鴨疫裏氏杆菌的分離鑒定及進化樹分析

鴨疫裏氏杆菌的分離鑒定及進化樹分析

吳翠娟^1,2，李福寶^1*李剛^2,3，張坤²，吳玉寒⁴，謝玉潔⁴

（1.安徽農業大學動物科技學院，安徽合肥 230036 ；2.中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100093；3.動物營養學國家重點實驗室，北京100093；4.合肥中大生物技術發展有限公司，安徽 合肥 230088）

摘要：從北京大興區鴨場和安徽合肥肥西鴨場中分離感染菌株，通過對病鴨的臨床症狀和從病鴨及死鴨的剖檢病變分析，疑似鴨疫裏氏杆菌病例進行病料的細菌分離，並對分離的病菌進行形態培養、PCR檢測、瓊擴試驗和外膜A蛋白的克隆，結果鑒定為鴨疫裏氏杆菌，分別命名為BJY-2、BJYX-1和AH-1。並將測序結果與GenBank上公布的我國常見幾種血清型相關序列進行比對，通過進化樹分析結果發現BJY-2的外膜蛋白序列與FJ765034-RA2的最近；BJYX-1的外膜蛋白序列與FJ765033-RA1的相同；AH-1的外膜蛋白序列與5個血清型的較遠。

關鍵詞：鴨疫裏氏杆菌；分離；克隆；進化樹分析

鴨疫裏氏杆菌病是由鴨疫裏氏杆菌(Riemerella anatipestifer, RA)引起的鴨、鵝、火雞等多種禽類的一種急性或慢性傳染病^[1]，主要侵害2～7周齡雛鴨，是現代養鴨業中造成小鴨嚴重死亡的主要傳染病之一。我國郭玉璞等^[2]於1982年在北京首次發現此病,此後在全國各地等許多地區均有發生本病的報道。該病病原為鴨疫裏氏杆菌,已報道有21種血清型^[3-4] , 各種血清型之間很少有交叉保護性^[5]。其中血清型1型、2型臨床上最為常見, 且致病力最強。

外膜A蛋白 (OmpA)具有很強的免疫原性，它可以激發機體的體液免疫反應還可以引起細胞免疫，而且具有交叉保護作用^[6]。吳芳等^[7]用抑製性差減雜交(SSH)試驗發現，OmpA基因還與RA毒力有關。本研究對分離出的3株RA的OmpA基因進行克隆和序列分析，旨在從係統進化角度探討分離株與其它血清型之間的毒力關係。並為其臨床診斷和分子鑒定提供一定的理論依據。

一 材料與方法

（一）發病情況

2008年10月，北京大興相繼幾個鴨場2周齡雛鴨和成年鴨均有發病，且發病率高達10%。同期，安徽合肥肥西鴨場6周齡鴨發病，兩個地區的病鴨發病狀況相似，主要臨床症狀：精神萎靡，排黃白色或黃綠色稀便，咳嗽，從眼睛和鼻腔流出多量粘性或漿性分泌物，腹瀉、頭頸歪斜、不時甩頭、有的腳肢麻痹、臥地不起，瀕死期呈角弓反張。屍體剖檢主要病理變化：鼻腔內積有粘液性分泌物；腦膜充血；心包內積有淡黃色纖維性滲出液，心包膜增厚；肝腫脹，表麵覆蓋一層淡灰色纖維素樣膜；心包液混濁，心包表麵有針尖大小的幹酪樣結節。  

（二）病料來源及分離菌的鑒定

1.病料來源

病鴨來自北京大興區和安徽合肥地區自然發病鴨場，無菌采取瀕死期鴨的心血、腦、肝組織。

2.培養性狀觀察

各組織分別接種於麥康凱培養基、鮮血瓊脂平板和鴨疫裏氏杆菌營養瓊脂平板（簡稱RA板）。其中RA板置燭缸中培養，麥康凱和血平板常規培養均37℃ 24h～48h，觀察細菌的生長情況、菌落特征及溶血情況等。

3.形態及染色特性

將分離菌株接種於RA板, 37 ℃燭缸法培養24 h後的培養物進行革蘭氏和瑞氏染色, 光學顯微鏡下觀察細菌的形態和染色特性。

4. PCR鑒定 

對疑似鴨疫裏氏杆菌病例進行PCR檢測，采用引物^[8]P1、P2可擴增809bp的DNA片段。引物序列為：P1：5’ACTCAAGGAAGAGCGGATCA 3’；P2：5’GCTTCAGCAGAACCAACTCC 3’，PCR反應產物經瓊脂糖凝膠電泳分析。

（三）瓊擴實驗 

按文獻^[9]方法：取大量接種於RA板培養物，懸浮於1ml的8.5% NaCl中，在沸水中煮沸5min，冷卻後，4000r/min離心5min，上清液即為瓊擴抗原。操作按常規方法進行，中間孔加抗原，外周孔加陽性、陰性血清。放入濕盒內37℃ 48h～72h，觀察反應結果。

（四）基因克隆、測序及序列分析 

 陽性PCR產物采用DNA回收試劑盒回收目的片段，然後連接pGM-T載體，轉化到TOP10感受態細胞，經藍白斑篩選陽性克隆，並送至上海生工生物工程公司測序。目的片段的回收、連接及轉化均按文獻^[10] 報道的方法進行。采用DNA Star軟件對3菌株的OmpA基因序列與國內常見血清型菌株的相應序列進行分析比較，繪出係統進化樹。

2 結果

（一）細菌的分離及培養特性

病料接種RA板，經37℃燭缸法培養24h～48h後，為光滑、微突起、透明、奶油狀、直徑為lmm～2.0 mm菌落。鮮血瓊脂上長出乳白色、半透明、微凸起的圓形菌落。接種在麥康凱瓊脂平板上均不生長。

（二） 形態及染色特性

細菌純固體培養物經革蘭氏染色結果為陰性、無芽孢的小杆菌，見稍長的絲狀菌狀；瑞氏染色呈兩極濃染。

（三） PCR鑒定結果 

不同鴨場分離株進行PCR擴增，產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析均出現809 bp大小的目的片段 。   

（四）瓊擴試驗結果

在陽性血清和抗原孔之間產生明顯的特異性沉澱線，陰性血清與抗原無沉澱線。

（五） 菌株DNA序列分析

利用DNA Star對3株的OmpA核苷酸序列進行分析顯示：BJYX-1與RA1型和RA2型株的同源性為100%，與RA3型、RA4型和RA5型株同源性均為99.9%，隻有1個核苷酸差異；BJY-2與RA1型和RA2型株的同源性最高為99.8%，隻有2個核苷酸差異，與RA3型、RA4型和RA5型株同源性均為99.6%；AH-1與RA1型和RA2型株的同源性最高為99.3%，與RA3型、RA4型和RA5型株同源性均為99.1%。但BJYX-1和BJY-2分離株與AH-1分離株的同源性分別為99.3%和99.0%，差異較大。比對證實該目的片段為RA的OmpA基因序列^見表1。

（六）係統進化樹分析

BJYX-1株、BJY-2株和AH-1株和中國常見的5種血清型的進化樹分析表明：BJY-2與FJ765034-RA2的OmpA序列最近，說明BJY-2 分離株與RA2型毒力和血清型靠近；BJYX-1與FJ765033-RA1的OmpA序列相同，說明BJYX-1 分離株與RA1型毒力和血清型靠近；AH-1與5個血清型代表序列較遠。

3 討論與小結

本實驗對分離菌的培養特性和形態觀察、PCR試驗、瓊擴試驗，以及OmpA基因測序，確定2008年10月北京大興區和安徽合肥肥西鴨場中流行的傳染性疫病，均是由RA引起的鴨疫裏氏杆菌病。通過測序結果和GenBank上公布的我國常見5種血清型的OmpA比對分析，BJYX-1與RA1型和RA2型株的同源性均為100%，但進化樹顯示與RA2近； BJY-2與RA1型和RA2型株的同源性均為99.8%，與RA1近；AH-1與RA1型和RA2型株的同源性均為99.3%。但北京大興的BJYX-1和BJY-2分離株與安徽合肥肥西AH-1分離株的同源性差異很大，也許是屬於這5型之外的其他血清型；這和RA複雜的血清型的相關報道是一致的。

外膜蛋白是革蘭氏陰性菌外膜的主要結構成分，具有免疫原性且能誘導保護性免疫反應^[11]。吳芳等^[7]通過抑製性差減雜交試驗發現外膜蛋白為RA可能的毒力基因，但沒有發現明確區分RA毒力和非毒力菌株的標誌基因。近年來，用於預防鴨疫裏氏杆菌感染的疫苗，雖有滅活苗、弱毒苗、亞單位疫苗等, 但由於RA 的多血清型，且菌苗所誘導的免疫力具有血清型特異性，所以效果不佳。因此理想的菌苗應含有主要血清型菌株，以提供有效的保護。周祖濤等^[11]通過對OmpA的研究來說明OmpA是RA最主要的外膜蛋白，而且各血清型的OmpA蛋白同源性較高，因此可以用OmpA基因的表達產物建立ELISA方法檢測RA所有的血清型。

當前鴨疫裏氏杆菌感染呈全球性流行, 是造成養鴨業經濟損失的最主要傳染病之一, 其血清型之多、地域分布之廣、加之用藥治療易產生耐藥性, 使得對該病的防製工作相當繁重^[12]。因此建議預防此病（1）加強飼養管理和場區環境衛生，定期進行場地消毒，杜絕或減少各種應急因素的產生。（2）對於鴨疫裏氏杆菌發病嚴重地區,建議在飼料中定期按療程添加一些敏感藥物進行預防，但注意不能濫用，以防鴨產品的藥物殘留，而影響其產品對人的安全性。

參考文獻：（略）