常量肉湯稀釋法測定抗菌藥物最低抑菌濃度（MIC）

1.抗菌藥物貯存液製備 抗菌藥物貯存液濃度不應低於1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍於最高測定濃度。溶解度低的抗菌藥物可稍低於上述濃度。抗菌藥物直接購自廠商或相關機構。所需抗菌藥物溶液量或粉劑量可公式進行計算。例如：需配製100 ml濃度為1280μg/ml的抗生素貯存液，所用抗生素為粉劑，其藥物的有效力為750μg/mg。用分析天平精確稱取抗生素粉劑的量為182.6 mg。根據公式計算所需稀釋劑用量為：（182.6 mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然後將182.6 mg抗生素粉劑溶解於107.0ml稀釋劑中。製備抗菌藥物貯存液所用的溶劑和稀釋劑見表5。配製好的抗菌藥物貯存液應貯存於-60℃以下環境，保存期不超過6個月。

2.藥敏試驗用抗菌藥物濃度範圍 根據NCCLS抗菌藥物敏感性試驗操作標準，藥物濃度範圍應包含耐藥、中介和敏感分界點值，特殊情況例外。

3. 培養基 NCCLS推薦使用Mueller-Hinton（MH）肉湯，pH7.2~7.4。需氧菌及兼性厭氧菌在此培養基中生長良好。在測試葡萄球菌對苯唑西林的敏感性時，應在肉湯中加入2%（W/V）氯化鈉，按製造廠家的要求配製需要量的MH肉湯。嗜血杆菌屬菌使用HTM肉湯，肺炎鏈球菌和其它鏈球菌使用含2%~5%溶解馬血的MH肉湯。

4.接種物的製備 有2種方法配製接種物，一是細菌生長方法，用接種環挑取形態相似待檢菌落3-5個，接種於4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉湯中，35℃孵育2-6h。增菌後的對數生長期菌液用生理鹽水或MH肉湯校正濃度至0.5麥氏比濁標準，約含1~2×108CFU/ml。二是直接菌落懸液配製法，對某些苛養菌，如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和鏈球菌及甲氧西林耐藥的葡萄球菌等菌株，推薦直接取培養18~24h的菌落調配成0.5麥氏比濁標準的菌懸液。用MH肉湯將上述菌懸液進行1∶100稀釋後備用。注意應在15分鍾內接種完配製好的接種物，並取一份接種物在非選擇性瓊脂平板上傳代培養，以檢查接種物純度。

5.稀釋抗菌藥物的製備及菌液接種 取無菌試管（13×100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉湯外，其餘每管加入MH肉湯1ml，在第1管加入抗菌藥物原液（如1280μg/ml） 0.4ml混勻，然後吸取1ml至第2管，混勻後再吸取1ml至第3管，如此連續倍比稀釋至第11管，並從第11管中吸取1ml棄去，第12管為不含藥物的生長對照。此時各管藥物濃度依次為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然後在每管內加入上述製備好的接種物各1ml，使每管最終菌液濃度約為5×105CFU/ml。第1管至第11管藥物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125μg/ml。

6.孵育 將接種好的稀釋管塞好塞子，置35℃普通空氣孵箱中孵育16~20h；嗜血杆菌和鏈球菌在普通空氣孵箱中孵育20~24h；對可能的耐甲氧西林葡萄球菌和耐萬古黴素腸球菌應持續孵育滿24h。

7.結果判斷與解釋 在讀取和報告所測試菌株的MIC前，應檢查生長對照管的細菌生長情況是否良好，同時還應檢查接種物的傳代培養情況以確定其是否汙染，質控菌株的MIC值是否處於質控範圍。以肉眼觀察，藥物最低濃度管無細菌生長者，即為受試菌的MIC。甲氧苄胺嘧啶或磺胺藥物的肉湯稀釋法終點判斷，與陽性生長對照管比較抑製80%細菌生長管藥物濃度為受試菌MIC。
根據NCCLS推薦的分界點值標準，判斷耐藥（resistant, R）、敏感(susceptible, S)或中介（intermediate, I）。S表示被測菌株所引起的感染可以用該抗菌藥物的常用劑量治療有效，禁忌症除外。R指該菌不能被抗菌藥物的常用劑量在組織液內或血液中所達到的濃度所抑製，或屬於具有特定耐藥機理（如β-內酰胺酶），所以臨床治療效果不佳。I是指MIC接近藥物的血液或組織液濃度，療效低於敏感菌。還表示被測菌株可以通過提高劑量（如β-內酰胺類藥物）被抑製，或在藥物生理性濃集的部位（如尿液）被抑製。另外，中介還作為“緩衝域”，以防止由微小的技術因素失控，所導致較大的錯誤解釋。

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