影響褐變的因素很多,植物的種類褐基因型、外植體的來源和生理狀況以及培養基的成分都會不同程度的影響褐變的程度。一般木本植物的外植體比較容易產生褐變現象,在成年樹尤其嚴重。培養基中含酚過高會導致褐變,含過高濃度的無機鹽和肌醇也會加劇外植體的褐變。6-苄氨基嘌呤(6-BA)和激動素(KT)也有誘導褐化的作用。強光和高溫同樣會促進褐化現象。
為了防止外植體的褐變,需要選取酚類化合物含量較低的實驗材料,選擇無機鹽含量較低,不加肌醇的培養基,並在較弱的光線或黑暗的條件中進行培養。
在培養基中加入抗氧化劑是防止褐變的有效措施。常用的抗氧化劑有抗壞血酸(VC)、檸檬酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等。可用抗氧化劑溶液預先處理外植體,或者在抗氧化劑溶液中切割和剝離外植體。必要時還可以將幾種抗氧化劑結合使用。也可以將抗氧化劑加入到培養基中。另一種方法是在培養基中加入0.5~1%的活性炭,吸附對生長有抑製作用的褐色醌類物質。應當注意的是:活性炭也能吸附培養基中的激素類物質,影響莖尖的分化和生長,因此在使用活性炭的場合,需要適當提高培養基中激素的濃度。還有一種辦法是不斷地(每隔1~2d)將培養物轉移到新鮮的培養基上,以擺脫老培養基中褐色物質的不利影響。在使用液體培養基的情況下,這種方法相當有效。
1.在培養基中添加活性碳可以防止植物組織自身的酚類物質排泌和變褐老化。對形態發生和器官形成有良好作用。一般認為,活性碳主要吸附非極性物質及色素大分子,可以減少一些有害物質的影響,但是具體吸附的選擇性很差,溫度低時吸附力增強,溫度高是吸附力減弱,甚至會解吸附。通常使用濃度為0.5-10g/L。加入活性炭後使培養基變黑,對一些植物誘導生根有利。大量活性炭的加入會削弱瓊脂的凝固能力,因此要多加些瓊脂。很細的活性炭容易沉澱,因此通常在瓊脂將要凝固時,需輕輕搖動培養瓶。
2.植物外植體組織在接種時的切割麵會溢泌一些酚類物質,在接觸空氣中的氧氣後其會氧化為相應的醌類物質,產生可見的茶色、褐色或黑色,此即謂“酚汙染”。在木本植物,尤其是熱帶木本植物及少量草本植物中,此現象較為嚴重。常用的防治措施如下:
A.試用抗酚類氧化的藥劑(半胱氨酸及其鹽酸鹽、二硫蘇糖醇、穀胱甘肽、抗壞血酸等。該類藥劑一般需用濃度為50-200mg/L。用經過濾滅菌的藥液洗滌剛切割的外植體傷口表麵,或加入固體培養基的表層,或將剛切割的外植體浸入其中一定時間)
B.適當降低培養基溫度。
C.接種後先進行一定時間的暗培養。
D.及時轉接入新鮮培養基。
E.選擇切取外植體部位等。
經驗之談:
1、易發生褐化的作物在進行組織培養時,先進行預培養(即培養在基礎培養基中)2~3天(如果分泌物多,如利用花魔芋的球莖進行組織培養時,適當延長預培養時間並多次更換培養基),再培養到添加了激素的培養基上。
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