仙人掌杆菌的檢測

一﹑簡介與意義:

      仙人掌杆菌(又稱臘腸杆菌)，此類細菌分布極廣，常汙染實驗室之檢體，且革蘭氏染色結果時有變異，故易與革蘭氏陰性杆菌混淆，幸好因為它有產孢現象，可藉此加以區分。此類微生物在各類食品皆可分離，當此菌在食品中達10 個菌數，即可能發生食物中毒現象，其所引發的中毒現象可分成兩種型式，一為嘔吐型，主要係B.cereus產生毒素所致，屬毒素型，潛伏期短，約1-5小時，症狀似Staphylococcus aureus引起之腸胃道症狀;另一是腹瀉型，與B.cereus產生腸毒素有關，這種案例在某些地區時常發生，潛伏期4-16小時。此菌為G(+)，好氣性，長杆菌，主要存在土壤中，容易經由土壤﹑水汙染生菜﹑米，進而交叉汙染到其它食品，生食到上述汙染食品時，即會發生食品中毒，因此菌產孢，較為耐熱，如果食品經煮熟後，每每有少數孢子殘存，倘若又未迅速冷卻，致使孢子易萌芽，進而造成食物中毒，過去曾有多起案件，所以預防此類微生物引發的食物中毒，食物之保藏是相當的重要。

二﹑原理:

(一)分離與篩選:利用MYP與KG平板培養來分離菌落，並利用B.cereus在此兩種平板產生典型菌落，來完成計數與分離。

1.MYP agar(Mannitol-Egg yolk-Polymyxin agar):篩選:利用多黏菌素Polymyxin抑製雜菌。分離:利用

   B.cereus分解蛋黃(egg yolk)，使菌落呈現混濁現象，並藉B.cereus不能發酵這種培養基唯一的糖類

  (Mannitol)，因此這種菌菌落不會有黃色出現(酚紅在酸性下會變成黃色，原來為紅色)。

2.TSB agar:原理同MYP agar，但缺少Mannitol，因此少了一種可篩選的特征。

(二)生化試驗:

1.觸酶試驗(Catalase test):此菌具有Catalase，可分解3% H₂O₂產生氣泡現象。

2.嫌氣下利用葡萄糖:此菌可在嫌氣下發酵葡萄糖，可使覆蓋石蠟之酚紅葡陶糖培養基變成黃色

3.硝酸鹽還原性(Reduction of nitrate):此菌具有此還原性，可將硝酸鹽nitrate (NO₃)還原成亞硝酸鹽nitaite (NO₂)，當加入指示劑時，NO2可與指示劑反應產生紅色現象。

4.石蕊牛乳試驗(Litmus milk test):此菌具有蛋白質分解酵素(Protease)，可將脫脂乳(Skim milk)中蛋白質分解成蛋白凍peptone，而使培養基變成澄清現象。

5.明膠分解試驗(Hydrolysis of gelatin):此菌可分解明膠，可將培養此菌的明膠培養基放在4-10℃冰箱中，30分鍾後，明膠會有不凝固現象。

6.澱粉分解試驗(Hydrolysis of starch):此菌可水解澱粉，所以將碘試劑加入澱粉培養基(Starch agar)中，此菌菌落周圍會出現透明圈，係因該區澱粉已被水解。

7.V-P test:此菌V-P反應呈現(-)。

8.溶血試驗:此菌具有溶血作用，可使血液培養基(Blood agar)平板之菌落出現透明環。

9.酚紅糖類試驗:此菌不利用甘露糖醇(D-Mannitol)，在含有此種糖類之培養基不會變色(紅色)，而此菌可利用蔗糖(Sucrose)，水楊甘(Salicin)，甘油(Glycerol)，因此含有這三種糖類的培養基會呈酸性(黃色)，但不產氣。

三﹑使用藥品﹑樣品與培養基

(一)培養基

1.甘露糖醇-蛋黃-多黏杆菌素(洋菜)培養基(Mannitol-Egg yolk-Polymyxin agar，簡稱MYP agar)

牛肉抽出物(Beef extract) 1g 蛋白凍(Peptone)  10g

D-甘露糖醇(D-Mannitol) 10g  氯化鈉(NaCl) 10g

酚紅(Phenol red) 0.025g 洋菜(Agar) 15g

蒸餾水(Distilled water) 900ml  

加熱溶解後，以121℃滅菌15分鍾，最後pH值為6.8±0.2，冷卻至50℃，加入50ml無菌之蛋黃液(a)及每ml含1萬單位的多黏杆菌素B硫酸鹽(Polymyxin B sulfate)溶液10ml(b)。培養基注入培養皿前，應搖動混合，使絮狀沉澱物分散均勻，搖動時應避免產生氣泡。

(a)蛋黃液之配製:雞蛋洗淨，浸入0.1%氯化汞溶液1小時，再浸入70%乙醇溶液中30分鍾，取出蛋黃加入等量

    之無菌生理食鹽水。

(b)每ml含1萬單位多黏杆菌素B硫酸鹽溶液之配製:取50萬單位多黏杆菌素B硫酸鹽，溶於33.3ml蒸餾水後，

    再以具有0.45um孔徑濾膜做無菌過濾。

      2.胰化酪蛋白-大豆-多黏杆菌素培養液(Trypticase-Soy-Polymyxin Broth，簡稱TSB):同葡萄狀球菌實驗

      3.營養洋菜培養基(Nutrient agar):同E.coli實驗

      4.營養培養基(Nutrient broth):同E.coli實驗

      5.酚紅葡萄糖培養液(Phenol red glucose broth):同金黃色葡萄狀球菌實驗

      6.硝酸鹽培養基(Nitrate broth)

(二)藥品:

     1.亞硝酸鹽試驗:

A solution:1g對-胺基苯璜酸(Sulfonilic acid)溶於125ml之 5N 醋酸(acetic acid)中。

      B solution:1g α-柰酚(α-naphthol)溶於200ml之5N 醋酸(acetic acid)中。

     2.碘試劑:1g KI溶於5ml蒸餾水;加0.5gI₂完全溶解後再加蒸餾水成100ml。

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