微生物固體培養基凝固劑研究進展

  微生物固體培養基凝固劑研究進展

    在一般常態培養溫度下呈固體狀態的培養基都稱固體培養基。固體培養基的凝固劑一般不是微生物的營養成分,隻起固化或粘合作用。常見凝固劑有瓊脂、明膠、無機矽膠等[1]。此外,由於微生物快速檢測的巨大需求而研製的微生物快速測試片,是通過凝固劑將營養成份和特異顯色物質粘附在塑料載體上而成,使用前不需進行培養基製備和加熱而可直接應用。測試片中凝固劑有瓜爾膠、黃原膠、刺槐豆膠、聚丙烯酸係高分子化合物等[2]。

1　瓊脂

1.1　瓊脂的成分與分子結構　瓊脂(agar)產自石花菜或其他幾種紅海藻,包含有兩個組分:一個是可以形成結實而強力的凝膠,稱“瓊脂糖”(agarose);另一個則是不會發生凝膠化的組分,稱“瓊脂膠”(a garopectin)。瓊脂糖約占天然瓊脂80%,瓊脂膠是瓊脂糖的硫酸酯。由於瓊脂的來源不同,瓊脂糖和瓊脂膠的含量也隨之變化[3]。瓊脂糖分子以線型鏈的形式存在,它是紅海藻的一個成分,與iota 和kappa 卡拉膠成鏡像關係。這一線型分子鏈包含有以(1→3)聯結的β-D 吡喃半乳糖基單元(A單元)與以(1→4)聯結的3,6 失水α-D 吡喃半乳糖基單元(B單元)相聯結。A單元及B單元構成二糖單元,因3,6 失水環接近於每個B單元,它可以很容易變化而發生水解。瓊脂糖的二糖單元及二級結構可表示如圖1[3,4]:

1.2.1　形態特征:成品瓊脂一般分為細長條狀和粉末狀。細長條狀的瓊脂在市場上常被稱為“洋菜”,色類白或淡黃色;半透明,表麵皺縮,微有光澤,質輕軟而韌,不易折斷;完全幹燥後,則脆而易碎;無嗅無味[3]。

1. 2. 2　溶解性:高純度的瓊脂在常溫下實際上不溶於水,隻吸收水分發生溶脹和微微地溶於乙醇胺和甲酰胺,在接近沸騰的情況下可分散到中水形成溶膠。其濃度達到15g/L的溶液時仍清澈透明[3]。

1. 2 .3　凝膠化溫度:瓊脂的凝膠化溫度遠低於凝膠融化溫度,其可用於微生物固體培養基的凝固劑也是因為這一點。由不同種類的原料所製取的瓊脂,明顯地具有不同的凝固溫度,但來自相同原料的瓊脂,其凝固溫度基本上是一致的。用於微生物固體培養基凝固劑瓊脂的凝膠化溫度一般在35℃～40℃,而凝膠熔點應在75℃～85℃[3]。酸堿度對瓊脂的凝固性影響很大,而高溫高壓(1 1kg/cm2,1×105Pa)的影響很小。酸堿度是瓊脂在正常濃度範圍內能否凝固的關鍵因素。當4. 30<pH<10.05時,瓊脂水溶液均可正常凝固,超過此範圍,培養基不能正常凝固[5]。

1.3　瓊脂的凝膠化原理　凝膠化是指體型縮聚反應進行到一定程度,反應體係的黏度突然增加,並且出現具有彈性凝膠的現象。此時,體係中包含了兩部分:一部分是凝膠,它具巨型網絡結構,不溶於一切溶劑;另一部分是溶膠,其分子量較小,被籠罩在凝膠的網絡結構中[6]。因此,凝膠是介於固體和液體之間的一種物質狀態。根據交聯方式,凝膠可分為化學交聯和物理交聯兩種。化學交聯是高分子鏈段間以共價鍵交聯起來,這種交聯很牢固,使高分子隻發生溶脹,而不能熔融更不溶解。物理交聯包括有氫鍵、庫倫力、配位鍵及物理纏結等形成的線性分子間的交聯[7]。瓊脂依靠高分子鏈段相互作用間可形成氫鍵而成為凝膠結構。這種氫鍵會因加熱等而被破壞,使凝膠變為溶膠[8]。瓊脂的凝膠化主要是其瓊脂糖之間氫鍵結合的結果,其含有的大量的水在網絡結構穩定上發揮了重要的作用[9]。凝膠中水有幾種狀態存在,在高分子網絡附近的水與網絡有很強的相互作用。將緊挨著高分子網絡的,在極低溫度下也不凍結的水稱為不凍水;而將在 10℃ 20℃才凍結的水稱為束縛水;離網絡很遠的水,顯示與普通水同樣的性質,稱作自由水[7]。在溶膠狀態,溫度接近水沸點時,瓊脂分子是一種隨機卷曲狀態。溫度降至凝固點,在凝膠狀態時,瓊脂分子相互交聯,形成三維網絡結構,基本結構為左手雙螺旋。沿著螺旋軸兩側有很大的空穴,使瓊脂能結合足夠多的水[4]。瓊脂的流變性變化是瓊脂凝膠化過程中的一個重要特征。在溫度高時,其流變行為與稀溶液中的聚合物流變行為相似;在溫度低至凝固點以下時,流變行為像交聯的聚合物;溫度在溶膠和凝膠的變化過程中,流變性更為複雜。另外,瓊脂的流變性受瓊脂的濃度、分子量以及其它的物質(如甘油)的影響[10～12]。

1. 4　瓊脂在微生物固體培養基凝固劑方麵的應用　瓊脂是微生物固體培養基和半固體培養基中最常用的性能優良的凝固劑。在液體培養基中加10～20g/L的瓊脂後加熱融化,凝固後即可得固體培養基,加5g/L的瓊脂可得半固體培養基[1]。陳宏偉經過多次試驗後提出:用凝膠強度來計算瓊脂的用量更為科學。固體培養基的適宜凝膠強度為250～450g/cm2之間,這樣硬度的固體培養基,既有利於物質的擴散和微生物對物質的吸收,又有一定的硬度,有利於劃線、塗布和影印等技術的操作。而半固體培養基的適宜凝膠強度為90g/cm2左右,這樣的培養基既可以凝固而不流動,又不影響菌體的運動,用手輕輕敲打試管即可使培養基破碎[13]。

2　明膠明膠(gelatin)是膠原蛋白經適度降解變性而得到的產物。作為一種蛋白質,明膠的氨基酸組成較為特殊,其含硫氨基酸很少,而甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸四種氨基酸含量很高,約占總氨基酸的67%。明膠大分子是由若幹種氨基酸以肽鍵和次級鍵連接而成,肽鍵和次級鍵決定了大分子的結構,次級鍵有氫鍵、鹽鍵、疏水鍵、酯鍵和二硫鍵等。明膠溶液的溫度在熔點以上時其分子呈無規則線團構象。當溫度降至凝固點以下時,明膠分子的某些鏈段複旋為左手螺旋。相鄰3條左手螺旋鏈間產生氫鍵交聯,複性為類似膠原的右手超螺旋結構[14]。明膠成品為無色或淡黃色的透明薄片或微粒。明膠不溶於冷水,但可緩慢吸水膨脹軟化,明膠可吸收相當於其重量5～10倍的水。明膠可溶於熱水,形成熱可逆性凝膠[14]。明膠是最早用來作為凝固劑的物質,用量為液體培養基的5%～12%。可是由於明膠的融化溫度(約25℃)和凝固溫度(約20℃)相差不大、比較容易被微生物分解、不適於較高溫度下長期使用,以及耐加壓滅菌較差等缺點,已逐漸被瓊脂所代替[1]。

3　無機矽膠矽膠(silicagel)是由多聚矽酸經分子內脫水而形成的一種多孔性物質,其化學組Si02·XH20,屬於無定性結構。矽膠不溶於水和任何溶劑,無毒無味。由於矽膠為多孔性物質,具有較大的比表麵,而且表麵的羥基具有一定程度的極性,所以有很好的吸水性[15]。用於固體培養基的矽膠是由無機的矽酸鈉及矽酸鉀被鹽酸及硫酸中和時而形成的膠體,它不含有機物,主要用於分離與培養自養微生物的培養基[1]。

4　瓜爾膠瓜爾膠(guargum)是一種高純化多糖,就分子結構來說是一種非離子化的半乳甘露聚糖,它以β (1→4)鍵連接的聚D 吡喃甘露糖為主鏈,D 吡喃半乳糖支鏈以α (1→6)鍵連接在主鏈上,其中甘露糖與半乳糖的摩爾比約為2∶1[16]。瓜爾膠極易溶於冷水和熱水、無毒、在一般情況下不形成凝膠,不過在高壓滅菌鍋滅菌冷卻後可以形成凝膠。並且形成的凝膠在70℃以下是不可溶的[17]。瓜爾膠在固體培養基的用量為30～40g/L,根據其高溫不溶的特性,可用於嗜熱菌的分離和保藏。細菌和真菌在其上麵有良好的生長,真菌還要比在瓊脂上長得更好一些,而且瓜爾膠要比瓊脂便宜8倍,所以其有巨大的應用價值[17]。

5　卡拉膠卡拉膠(carrageenan)是從海藻中提取來的一種陰離子多糖,其結構根據原料來源不同而不同,可溶於熱水,不溶於乙醇、異丙醇等,基本骨架是α 1,3和β 1,4糖苷鍵交替聯結形成的半乳聚糖重複單元。卡拉膠的粘度很大,在濃度低至2g/L時也能形成凝膠,不過形成凝膠時是離子(K+或Ca+)依賴性的。卡拉膠約60℃熔化,45℃凝固[18]。由於卡拉膠是一種離子依賴型凝膠劑,所以無法完全代替瓊脂。但可用於某些微生物的培養,其用量約為10g/L[19]。

6　黃原膠黃原膠(xanthangum)是由D 葡萄糖、D 甘露糖、D 葡萄糖醛酸、乙酸和丙酮酸組成的“五糖重複單元”結構聚合體。主鏈和側鏈間通過氫鍵形成雙螺旋和多重螺旋結構[20]。黃原膠既能溶於熱水,又能溶於冷水;不能發生凝膠化;具有很強的粘性,具有高度的生物穩定性,多數酶類不能對其降解[20]。

7　刺槐豆膠刺槐豆膠(locustbeangum)是一種無色,無味的植物胚乳精製多糖。刺槐豆膠是以甘露糖為主鏈的半乳甘露聚糖,甘露糖與半乳糖的比例為1∶4,分子量大約為300kD。刺槐豆膠本身無凝膠特性,其最重要的特點是與瓊脂、卡拉膠及黃原膠等親水膠體有良好的凝膠協同效應,可使複合後的用量水平很低並改善凝膠組織結構。普通刺槐豆膠在冷水中隻有部分溶解,加熱至85℃保持10min以上才能充分水化[21]。

8　聚丙烯酸係高分子化合物聚丙烯酸係(PAA)高分子化合物是一種化學合成的高吸水性樹脂。高吸水性樹脂可以吸收自身質量的幾百乃至上千倍的水,不但具有優良的吸水性能,而且具有卓越的保水能力;即使加壓,所吸收的水也不溢出。自然界中能吸水的物質很多,按其吸水的性質來分,基本上分為兩類:一類是物理吸附,其吸水主要是毛細管的吸附原理,所以這類物質吸水能力不高,隻能吸收自重的幾十倍的水,一旦施壓,水就逸出。另一類是化學吸附,是通過化學鍵的方式把水和親水性物質結合在一起成為一個整體。此種吸附結合很牢,加壓也不會失水。高吸水性樹脂是由三維空間網絡構成的高聚物,它帶有大量親水基團(如羧基、羥基、羧酸鹽、酰胺基等)。它的吸水,既有物理吸附,又有化學吸附。因此,它具有神奇的吸水能力以及較高的保水能力[22]。

9　討論

雖然瓊脂已經被應用了100多年,它的可應用性也得到了大家的充分認可,可是由於其資源的過分開采而導致價格上升,尋找一種較便宜的膠體來代替很有必要。另外,有些情況下瓊脂並不適用,如高溫培養。這樣,需要人們去尋一種新的膠體來代替或兼而用之。過去一段時間裏,雖然人們做了大量的嚐試,取得了一定的成果,但仍未找到一種可以完全代替之的物質。所以,我們還要繼續努力,從瓊脂的可應用原理出發,來選擇新的膠體或來對現有的膠體改性,以達到應用目的。快速測試片由於其簡便、準確、省時、省力、可應用於現場等特點,將會在檢測部門廣泛推廣。可是現有產品的凝固劑吸水性不好,不能快而均勻地吸收水分,使菌體生長不均勻而導致檢測結果的偏差。所以尋找一種可用於檢測片的膠體也十分重要。隨著高分子化學的發展,天然高分子聚合物的凝膠化和流變性原理已越來越透徹,吸水、保水原理也已明確。對其改性得到所需的產品是可能的。聚丙烯酸係高分子化合物的合成機理和方法已經十分成熟,合成可用於測試片的高分子物質也是可行的。

參考文獻（略）

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