一株高效褐藻膠降解菌的篩選及其性質的初步研究
王麗娟 展長淑 孫彥粉 王振傑
（山東大學威海分校海洋學院，山東威海 264209）
摘要：從威海近海天然腐爛的海帶中分離得到10株褐藻膠降解菌。以海藻酸鈉為唯一碳源，通過馴化培養、初篩、複篩得到一株優勢菌。本課題對該優勢菌的最適生長條件及最適產酶條件進行研究，並對其酶的性質做了初步研究。
關鍵詞：褐藻膠降解菌；篩選；最適生長條件：最適產酶條件：降解酶性質
褐藻膠(algin)是褐藻細胞壁的填充物質，是一種由α-D-甘露糖醛酸和β-L-古羅糖醛酸兩種單糖組成的線形多糖[1]。褐藻膠應用廣泛，但其相對分子質量較大，導致其溶解度較低，溶液粘性較大，應用受到很大限製。近年來，褐藻膠寡糖生物活性的研究取得了重大進展，如調節植物生長、誘導植物抗病能力、抗腫瘤及抗老年癡呆，以及防治海洋無脊椎動物常見病的功能等[2]。因而通過各種降解方法製備的褐藻膠寡糖在糖化學、糖生物學、糖工程及糖類藥物研究領域具重要的研究價值。目前褐藻膠寡糖的獲取方法主要有物理降解法、酸降解法，氧化降解法和酶解法等。其中酶解法是一種條件溫和、可控性強和特異性高的生物降解方法，是目前的主要研究方向[3]。因此褐藻膠降解酶具有重要的開發價值和研究意義。本項目的研究重點在於利用微生物得到降解酶並最終獲得寡糖，通過誘導篩選出產酶量高、酶活性強的優勢菌株，確定出其最適生長條件和最適產酶條件，並對降解酶的性質做出初步研究。
1．材料與方法
1．1 材料
1．1．1 樣品采集
腐爛海帶采集於山東省威海市近海
1．1．2培養基成分
初篩培養基（g/L）：海藻酸鈉10；硝酸鉀1.0；氯化鈉15；磷酸氫二鉀0.5；硫酸鎂0.5；硫酸亞鐵 0.01；瓊脂15-20；水1000mL
馴化培養基（g/L）：褐藻酸鈉；氯化鈉15；蛋白腖1.0；磷酸氫二鉀1.0；磷酸二氫鉀1.0；磷酸氫二鈉1.0；硫酸鎂0.5；硫酸亞鐵0.01；水1000mL
複篩及發酵培養基（g/L）：褐藻酸鈉10;硫酸銨 5.0;磷酸氫鉀2.0;氯化鈉l5；硫酸鎂1.0；硫酸亞鐵0.01；酵母膏 1.0;水1000mL
保藏培養基（g/L）：牛肉膏5.0 ；蛋白腖10 ；磷酸氫二鈉 2；氯化鈉5;瓊脂5-7;水1000ml；PH7.4-7.6
1．2 實驗方法
1．2．1 菌株的馴化
用海水浸泡天然腐爛海帶，製備菌懸液，取1ml菌懸液移入到30ml含海藻酸鈉2g/L的馴化培養基中，同時觀察培養液的變化，3天後，取1ml馴化液至新鮮馴化培養基中，海藻酸鈉濃度按4、6、8、10g/L逐步提高，共馴化5代。
1．2．2 菌種的分離
取第5代培養液適當稀釋後塗布於牛肉膏蛋白腖培養基平板上。
1．2．3 菌種的初篩
將分離得到的單菌落接於初篩平板上，置
1．2．4 菌種的複篩
1．2．4．1製備液體菌株
將30ml發酵培養基裝入100ml三角燒瓶中，於
1．2．4．2
在100ml三角燒瓶中裝入發酵培養基50ml按2%（體積分數）的接種量接入液體菌種，
1．2．4．3寡糖含量與生物量的測定
生物量的測定：用721型分光光度計為620nm處測定發酵液的吸光度值，以空白發酵培養基作對照。
寡糖含量的測定：本實驗采用兩種方法測定寡糖含量。第一，可用3，5-二硝基水楊酸法測定酶解產物中還原糖的含量。反應體係溶液包括，1.0ml 1%海藻酸鈉溶液，4ml 0.1mol/L的Tris-HCl緩衝液和1ml發酵液，於
第二，將發酵液用高速離心機於8000r/min離心20分鍾，取上清液，用752型分光光度計於235nm處直接測定吸光度值以確定寡糖含量。
1．2．4．4優勢菌種測定
確定對褐藻酸鈉有較好降解能力的菌株作為降解優勢菌。
1．2．5優勢菌最適生長條件確定
以海藻酸鈉為唯一碳源，分別將優勢菌置於不同的海藻酸鈉濃度，溫度，鹽度，培養時間等條件下培養，測其生物量和寡糖含量。每組實驗重複3次，取其平均值，並確定菌種最適生長條件。
1．2．6降解酶性質的初步研究
用800mL培養基，2%接種量發酵增殖優勢菌種，48h後，將發酵液
2.結果與討論
2．1海藻酸鈉高效降解菌株的篩選
將從近海取得的腐爛海帶製備菌懸液，進行馴化後，利用稀釋塗布平板法進行分離及以海藻酸鈉為唯一碳源的初篩培養基平板進行篩選，初篩出10株可利用海藻酸鈉的菌株，其菌落形態見表1。
表1 10株分離菌株的菌落形態
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菌株編號 菌落形態 初篩平板上生長情況 |
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1 圓形，邊緣半透明，表麵較規則，凸出濕潤，白色，較小， 生長 2 單菌落，邊緣不透明，表麵不規則，凸出，幹，灰色，較大 生長 3 滿皿，白色菌絲，表麵不規則，分枝產黑色孢子 生長 4 圓形，邊緣不透明，表麵不規則，有菌絲，黑色 生長 5 圓形，邊緣半透明，表麵規則，凸出濕潤，乳白色 生長 6 單菌落，邊緣半透明，表麵不規則，凸出濕潤 生長 7 單菌落，邊緣不透明，表麵不規則，有菌絲，分枝產生孢子 生長 8 圓形，邊緣半透明，表麵不規則，淡黃色 生長 9 圓形，邊緣半透明，表麵規則，黃色，凸出濕潤 生長 10 圓形，邊緣不透明，表麵規則，白色 ，凸出濕潤，較小 生長 |
再通過測定生物量和寡糖含量來檢測該株菌降解海藻酸鈉的能力。結果經平板分離後得到10株菌可在以海藻酸鈉為唯一碳源的培養基上生長，而10號菌株的酶活力明顯比其他菌株強，亦即該菌對海藻酸鈉有較強的降解能力。因此，本研究選定10號菌株作為海藻酸鈉高效降解菌。
2．2 優勢菌最適生長條件的確定
2．2．1 培養時間
通過發酵培養測定培養天數對該菌生長的影響。
2．2．2 海藻酸鈉濃度
以不同濃度的海藻酸鈉配製培養基，測定不同濃度的海藻酸鈉濃度對該菌生長情況和分解產生寡糖的影響。
菌液離心後235nm處測吸光度，以測定培養集中的寡糖含量。
褐藻酸鈉濃度為10g/L時菌種產酶量最大，隨後，隨著褐藻酸鈉濃度的增大，產酶量逐漸降低。即該菌種的最適產酶褐藻酸鈉濃度為10g/L。
2.2．3 NaCl濃度
測定不同NaCl濃度對該菌生長情況和分解產生寡糖的影響。
稀釋十倍後於620nm測菌液吸光度。由結果可知，NaCl濃度為20g/L時生物量達最大，該菌生長最好。NaCl濃度過高或過低均不利於該菌生長。在即該菌種的最適生長鹽度為20g/L。
離心後235nm測吸光度。NaCl濃度為15g/L時吸光度值達最大，即產酶量最大。最適產酶鹽度為15g/L。
2．2．4培養溫度
將該菌至於不同的溫度下進行培養，測定溫度對該菌株生長的影響。將分離得到的優勢菌種分別於
2.3降解酶性質的研究
發酵增殖優勢菌種並提取粗酶液，通過在不同的溫度、PH及底物濃度下的反應，稀釋十倍後，測定其235nm處吸光度值確定最適產寡糖條件，進而確定最適酶反應條件。
每一試管中加入2mL粗酶液和10mL濃度分別為0.2%，0.6%，1.0%，1.4%，1.8%，2.2%的海藻酸鈉水溶液，反應20分鍾後，加熱使酶失活，測定235nm處吸光度。
酶的最使反應底物濃度為1.8g/L。之後隨著底物濃度的增加酶活性基本不再增加。
每一試管中加入2mL粗酶液和10mL濃度分別為1%的海藻酸鈉水溶液，至於不同的pH條件下，反應20分鍾後，加熱使酶失活，測定235nm處吸光度。
酶的最使反應pH為7.2。pH過高或過低都會對酶活性產生影響,使酶活降低。
每一試管中加入2mL粗酶液和10mL濃度為1%海藻酸鈉水溶液，置於不同溫度條件下，反應20分鍾後，加熱使酶失活，測定235nm處吸光度。
酶的最使適應溫度為35℃。在一定範圍內，隨著溫度的升高酶活性逐漸增高，至35℃時隨著溫度的升高酶活性開始降低。
討論
本實驗篩選出10株降解褐藻膠的菌株並通過比較確定了酶活性最高的優勢菌株。並確定了其最適生長條件和最適產酶條件並對其酶的性質作出初步研究。該實驗表明低溫條件下該菌生長和產酶能力都比較低，說明該菌自然條件下對海帶的致病力不是很強，但該菌具有良好的體外降解褐藻膠的能力。
該菌的分類及其生理生化性質尚不明確，所產酶的結構性質和結構機理也不十分清楚，有待近一步研究。
參考文獻：
[1]宋凱,於文功，韓峰，等.海洋弧菌褐藻膠裂解酶的分離純化及性質[J].生物化學與生物物理學報.2003，35（5）：473-477
[2] 劉斌，王長雲，張洪榮，等.海藻多糖褐藻膠生物活性及其應用研究新進展[J].中國海洋藥物雜誌.2004，23（6）：36-41
[3] 楊釗,範瑩.不同降解方法製備褐藻膠甘露糖醛酸寡糖的結構特點.中國生化藥物雜.2007，28（1）：69-71
[4] 袁兆慧,韓麗君,林偉,等.褐藻酸降解酶的製備及其性質研究[J].海洋科學.2005，29（2）：78-80
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