幾種因素對噬菌體侵染大腸杆菌的影響研究

幾種因素對噬菌體侵染大腸杆菌的影響研究

摘要：通過利用λ噬菌體對大腸杆菌烈性侵染特性，研究了宿主生理狀態、pH、宿主數量、金屬離子及表麵活性劑等外界因素對侵染過程的影響，結果表明：宿主生理狀態最為重要，指數分裂期的宿主細胞最易受到侵染；pH6～8的中性條件下有利於噬菌體吸附增殖； 100mg/L鈣、鎂離子能夠促進吸附侵染過程；100mg/L鐵離子和0.2%吐溫80能夠抑製吸附侵染過程。

關鍵詞：噬菌體； 大腸杆菌 ； 宿主；侵染

噬菌體（Bacteriophage）是一類專性寄生的原核生物病毒，分布廣泛於土壤、空氣、水中或生物體內。根據噬菌體與宿主細胞的關係可分為烈性噬菌體（virulent phage）和溫和噬菌體（temperate phage）兩大類^[1]。噬菌體對發酵工業危害巨大^{[ 2-4]}，本文以λ噬菌體為模式病毒，研究幾種外界因素對噬菌體侵染宿主規律的影響。

1  材料和方法

1.1.   材料

1.1.1  菌種： E.colik₁₂Sgal^-（簡稱負菌）、E.colik₁₂F₂gal^-/λgal⁺/λ（簡稱正菌）

1.1.2　培養基及緩衝溶液

液體肉湯培養基：牛肉膏0.5%，蛋白腖1.0%，氯化鈉0.5%，pH7.2

上層半固體培養基：牛肉膏0.5%，蛋白腖1.0%，氯化鈉0.5%，瓊脂0.6 %，pH7.2

下層固體培養基：牛肉膏0.5%，蛋白腖1.0%，氯化鈉0.5%，瓊脂1.8%，pH7.2

加鎂磷酸緩衝液：KH₂PO₄ 2g ,K₂HPO₄ 7g ,MgSO₄.7H₂O 0.25g ,蒸餾水1000mL

1.2.   方法

1.2.1  λ噬菌體裂解液的製備^[5]

     液體肉湯培養基將正菌活化18h，離心收集菌體，緩衝液洗滌，紫外線照射10s～15s，黑暗培養3h，加入0.4mL氯仿劇烈振蕩30s～60s，靜止5min。離心（4000r/min）15min,上清液分別移入試管中,此液即為λ噬菌體裂解液。再次侵染負菌得到噬菌體富集液。

_________________

1.2.2噬菌體效價的測定

采用雙層平板法，將下層固體培養基倒平板凝固為底層平板，液體肉湯培養液將噬菌體裂解液10倍稀釋至10^-7，5mL融化的上層半固體培養基冷卻至45℃左右，分別加入0.5mL負菌敏感菌液，同時加入0.2mL不同稀釋度的噬菌體裂解液，迅速傾於底層平板上，輕輕搖勻，待凝固後，置37℃培養24h。統計平板上形成的噬菌斑數量，並計算其效價（噬菌體個數/ml）。

2 結果與分析

正菌菌株是整合λ噬菌體的溶源性大腸杆菌，負菌菌株的λ噬菌體整合能力缺失，因此正菌菌株經紫外線誘導後裂解的λ噬菌體，對負菌菌株則表現為烈性噬菌體的侵染效果。

2.1 紫外誘導大腸杆菌正菌裂解噬菌體的效價

經紫外誘變，正菌被裂解形成的噬菌體裂解液效價為： 2.743×10⁷個/mL

經負菌擴增得到的噬菌體富集液的效價為：1.097×10⁹ 個/mL 

2.2大腸杆菌的生理狀態對噬菌體侵染的影響

噬菌體在固體平板上侵染宿主能夠形成基本固定大小的噬菌斑，一般12h左右噬菌斑直徑大小不再擴展，說明噬菌體對宿主的侵染是有限製的，這種限製是否與大腸杆菌的生理狀態有關？將大腸杆菌負菌接種於液體肉湯培養基中，並等分到8個三角瓶中，37℃搖瓶培養，並每隔2h，取出一瓶接入稀釋的噬菌體，,同時無菌培養基接入噬菌體為對照，繼續培養到30h，分別稀釋後雙層平板法觀察噬菌體數量，結果見表1。

 以對照的噬菌斑結果為陰性結果，則表1顯示出前12h噬菌體能夠良好侵染宿主，而這個時期正是宿主的快速分裂期，12h後宿主進入穩定期，侵染力也隨之喪失，充分說明了噬菌體對宿主的侵染與宿主的生理狀態有關，這與固體平板上噬菌斑長到一定大小時不在擴展的結果是一致的。

表1  生理狀態對噬菌體侵染的影響

注：+++代表噬菌斑數大於300，

2.2 pH對噬菌體侵染的影響

配製不同pH的上層半固體肉湯培養基， 45℃水浴保溫，分別加入0.5mL的敏感菌液，同時加入0.2mL的噬菌體稀釋裂解液，搖勻後，雙層平板觀察噬菌斑生長情況。

表2 pH對噬菌體侵染的影響

注：+++代表噬菌斑數大於300  ++代表噬菌斑數大於200  –代表無噬菌斑生成

表3結果表明pH6.0～8.0時，大腸杆菌生長良好，同時也適合λ噬菌體的侵染。

2.3 敏感菌的數量對噬菌體侵染造成的影響

取6支已滅好菌的半固體肉湯培養基，分別加入0.1mL、0.2mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL的敏感菌液，同時迅速加入稀釋的0.2mL的噬菌體裂解液，搖勻迅速傾於底層為肉湯固體培養基平板上，輕輕搖勻，待凝固後，置37℃培養24h。

表3  敏感菌的數量對噬菌體侵染的影響

注：+++代表噬菌斑數大於300

由表3可知，不同量的敏感菌液對噬菌斑數量沒有明顯影響。

2.4 金屬離子濃度對噬菌體侵染造成的影響

在上層半固體培養基中分別加入不同濃度的不同金屬離子，再接入稀釋的噬菌體和宿主，觀察噬菌斑數量，以無離子為對照。

表4  金屬離子濃度對噬菌體侵染的影響

注：+代表噬菌斑數小於200  ++代表噬菌斑數大於200  +++代表噬菌斑數大於300

由表4可知，100mg/L的Ca²⁺ 、Mg²⁺能夠促進噬菌斑的生成，而100mg/L的Fe²⁺則減少了噬菌斑生成，表明Ca²⁺ 、Mg²能夠促進噬菌體對宿主的吸附，而Fe²⁺則抑製噬菌體對宿主的吸附，而其他的金屬離子K⁺、Mn²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺等則對噬菌體吸附沒有明顯的作用。

2.5  表麵活性劑（吐溫80）對噬菌體侵染造成的影響

半固體肉湯培養基中，加入0.2%的吐溫80，同時加敏感菌液和噬菌體裂解稀釋液，搖勻並迅速傾於底層培養基平板上，輕輕搖勻，待凝固後，置37℃培養24h，觀察噬菌斑生長情況。

表 活性劑（吐溫80）對噬菌體侵染的影響

注：+代表噬菌斑數小於200  ++代表噬菌斑數大於200

由表5可知，加入吐溫80後，噬菌斑減少，由於吐溫80是表麵活性劑，因此主要作用應該是減少了噬菌體對細菌細胞膜的吸附作用。

3 結  論

平板培養基上的噬菌斑長到一定程度，就不再繼續擴大，表明噬菌體對敏感菌株的侵染受到了一定的限製。研究了宿主的生理狀態、環境pH、敏感菌數量、金屬離子濃度、表麵活性劑等因素對噬菌體侵染大腸杆菌的影響，得出結論如下：（1）噬菌體侵染宿主時，宿主的生理狀態最為重要，處於指數分裂期的大腸杆菌更易被噬菌體侵染；（2）在pH6～8的中性條件下有利於噬菌體吸附增殖，而在過酸和過堿的情況下不易增殖；（3）一定條件下，敏感菌的數量對噬菌體的侵染影響不大；（4）較高濃度（100mg/L）的Ca²⁺、Mg²⁺對噬菌體的吸附增殖有促進作用；而同濃度的Fe²⁺對噬菌體的吸附增殖有阻礙作用，（5）0.2%表麵活化劑吐溫80可以破壞敏感菌的細胞膜，從而影響了噬菌體的吸附增殖。 該結論可能為降低發酵工業中噬菌體感染提供了一定的思路。

 參考文獻:

[1] 周德慶.微生物學教程[M]，北京：高等教育出版社，2002：63-81

[2] 鍾繼才.危害乳業的噬菌體的預防對策[J] .中國乳品工業，2006, 34( 7)：61-62

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[4] 劉瓊, 賴濱霞,廖付榮.卡那黴素抗噬菌體生產菌株的選育及應用[J] .福建畜牧獸醫 2004, 26(2)：3-4

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