實驗前玻璃儀器的預先處理

1、 進一步加強學習、掌握玻璃器具等器材的清洗、烘幹、包紮的包紮技術。

2、為下一次的課做好器材的準備工作。

二、原理

為確保實驗順利地進行，要求把實驗所用的玻璃器皿清洗幹淨。為保持滅菌後和無菌狀態，需要對培養皿、吸管等進行包紮，對試管和三角瓶等加塞棉塞。這些工作看起來很普通簡單，但如操作不當或不安操作規定去做，則會影響實驗結果，甚至會導致試驗的失敗。

滅菌原理：高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內的冷空氣從排氣閥中驅盡，然後關閉排氣閥，繼續加熱，此時由於蒸汽不能溢出，而增加了滅菌器內的壓力，從而使沸點增高，得到高於100℃的溫度。導致菌體蛋白質凝固變性而達到滅菌的目的。適用於一般培養基、玻璃器皿、無菌水、金屬用具。一般培養基在121．3℃滅菌20分鍾即可。幹熱滅菌是利用高溫使微生物細胞內的蛋白質凝固變性而達到滅菌的目的。細胞內的蛋白質凝固性與其本身的含水量有關，在菌體受熱時，當環境和細胞內含水量越大，則蛋白質凝固就越快，反之含水量越小，凝固緩慢。因此，與濕熱滅菌相比，幹熱滅菌所需溫度高（160—170℃），時間長（1—2小時）。但幹熱滅菌溫度不能超過180℃，否則，包器皿的紙或棉塞就會烤焦，甚至引起燃燒，因而一般塑料製品不能用幹熱滅菌。

三、試劑和儀器

（一）儀器

高壓蒸汽滅菌鍋、電熱烘箱、試管、三角瓶、培養皿和吸管、棉線、紗布、棉花、牛皮紙、報紙、矽膠塞等

四、實驗內容

（一） 玻璃器皿的清洗：

        新購的玻璃器皿的洗滌

將器皿放入２％鹽酸溶液中浸泡數小時，以除去遊離的堿性物質，最後用流水衝淨。

對容量較大的器皿，如大燒瓶、量筒等，洗淨後注入濃鹽酸少許，轉動容器使其內部表麵均沾有鹽酸，數分鍾後傾去鹽酸，再以流水衝淨，倒置於洗滌架上晾幹，即可使用。

        常用舊玻璃器皿的洗滌

確實無病原菌或未被帶菌物汙染的器皿，使用前後，可按常規用洗衣粉水進行刷洗；

吸取過化學試劑的吸管，先浸泡於清水中，待到一定數量後再集中進行清洗。

       帶菌玻璃器皿的洗滌

凡實驗室用過的菌種以及帶有活菌的各種玻璃器皿，必須經過高溫滅菌或消毒後才能進行刷洗：

1、帶菌培養皿、試管、三角瓶等物品，做完實驗後放入消毒桶內，用0.1MPa滅菌20～30 min後再刷洗。含菌培養皿的滅菌，底蓋要分開放入不同的桶中，再進行高壓滅菌。

2、帶菌的吸管、滴管，使用後不得放在桌子上，立即分別放入盛有3～5%來蘇爾或5%石炭酸或0.25%新潔爾滅溶液的玻璃缸（筒）內消毒24h後，再經0.1MPa滅菌20 min後，取出衝洗。

3、帶菌載玻片及蓋玻片，使用後不得放在桌子上，立即分別放入盛有3～5%來蘇爾或5%石炭酸或0.25%新潔爾滅溶液的玻璃缸（筒）內消毒24h後，用夾子取出經清水衝幹淨。

如用於細菌染色的載玻片，要放入50g/ L肥皂水中煮沸10min，然後用肥皂水洗，再用清水洗幹淨。

        最後將載玻片浸入95%酒精中片刻，取出用軟布擦幹，或晾幹，保存備用。

若用皂液不能洗淨的器皿，可用洗液浸泡適當時間後再用清水洗淨。

4、含油脂帶菌器材的清洗

單獨高壓滅菌：用0.1MPa滅菌20～30 min→趁熱倒去汙物→倒放在鋪有吸水紙的籃子上→用100 ℃烘烤0.5h→用5%的碳酸氫鈉水煮兩次→再用肥皂水刷洗幹淨。

（二）、玻璃器材的晾幹或烘幹

不急用的玻璃器材：可放在實驗室中自然晾幹；

急用的玻璃器材：把器材放在托盤中（大件的器材可直接放入烘箱中），再放入烘箱內，用80～120℃烘幹，當溫度下降到60℃以下再打開取出器材使用。

（三）器皿的包紮：

要滅菌後的器皿仍保持無菌狀態，需在滅菌前進行包紮。

（1）培養皿：洗淨的培養皿烘幹後每10套（或根據需要而定）疊在一起，用牢固的紙卷成一筒，或裝入特製的鐵桶中，然後進行滅菌。

（2） 吸管：洗淨、烘幹後的吸管，在吸口的一頭塞入少許脫脂棉花，以防在使用時造成汙染。塞入的棉花量要適宜，多餘的棉花可用酒精燈火焰燒掉。每支吸管用一條寬約4~5cm的紙條，以30~50℃的角度螺旋形卷起來，吸管的尖端在頭部，另一端用剩餘的紙條打成一結，以防散開，標上容量，若幹支吸管包紮成一束進行滅菌。使用時，從吸管中間擰斷紙條，抽出試管。

（3）試管和三角瓶：試管和三角瓶都需要做合適的棉塞，棉塞可起過濾作用，避免空氣中的微生物進入容器。製作棉塞時，要求棉花緊貼玻璃壁，沒有皺紋和縫隙，鬆緊適宜。過緊易擠破管口和不易塞入；過鬆易掉落和汙染。棉塞的長度不小於管口直徑的2倍，約2/3塞進管口。

目前，國內已開始采用塑料試管塞，可根據所用的試管的規格和試驗要求來選擇和采用合適的塑料試管塞。

若幹支試管用繩紮在一起，在棉花部分外包裹油紙或牛皮紙，再用繩紮緊。三角瓶加棉塞後單個用油紙包紮。

（四）、玻璃器材的滅菌

滅菌:幹熱滅菌:160～165℃烘箱中滅菌2h；或濕熱滅菌:121 ℃ 20～30min

        幹熱滅菌法

1、將包紮好的玻璃器皿擺入電熱烘箱中，相互間要留有一定的空隙，以便空氣流通。

2、關緊箱門，打開排氣孔，接上電源。

3、待箱內空氣排出到一定程度時，關閉上排氣孔，加熱至滅菌溫度後，固定溫度進行滅菌：160℃—165℃保持2小時。2小時後切斷電源。

4、待烘箱內溫度自然降溫冷卻到60℃以下後，再開門取出玻璃器皿，避免由於溫度突然下降而引起玻璃器皿碎裂。

高壓蒸汽滅菌法

1、關好排水閥門，放入純淨水或蒸餾水至標度。注意水量一定要加足，否則容易造成事故。

2、將須要滅菌的器材、培養基等裝入滅菌鍋中，加蓋密封。旋緊螺旋時，先將每個螺旋旋轉到一定程度（不要太緊），然後再旋緊相對的兩個螺旋，以達到平衡旋緊，否則易造成漏氣，達不到徹底滅菌的目的。

3、 通電加溫，打開排氣活門，排盡鍋內的空氣。通常當壓力表指針升至5磅或0.05MPa時，打開排氣活門放氣，待壓力表指針降至零點一小段時間後，再關閉活門。即活門衝出的全部是蒸汽時則表示徹底，此時可關閉排氣活門，如果過早關閉活門，排氣不徹底，也達不到徹底滅菌的目的。

4、恒溫滅菌: 0.1MPa 或15磅壓力保持20～30分鍾。壓力表的指針上升時，鍋內溫度也逐漸升高，當壓力表指針升至0.1MPa時或15磅時，鍋內溫度相當於120℃～121℃（等於一個大氣壓），此時開始計算滅菌時間，控製熱源，使處於0.1MPa 或15磅壓力保持20～30分鍾，即能達到完全滅菌的目的，然後停止加溫。當達到所需溫度時開始計時，並在此溫度下保持所需的時間。

5、降溫：自然降溫或打開活門排汽降溫。稍微打開一點排氣活門，使鍋內蒸汽緩慢排除，然後逐漸開大活門，氣壓徐徐下降，注意勿使排氣過快，否則會使鍋內的培養基沸騰而衝脫或沾染棉花塞，但排氣太慢又使培養基在鍋內，受高溫處理時間過長，對培養基也是不利的。一般從排氣到打開鍋蓋以10分鍾左右為好。

6、當鍋內蒸汽完全排盡時即壓力表指針降到零時，要立即打開鍋蓋。

7、取出滅菌物品：當鍋內溫度下降到60℃左右時器材或培養基。如培養基需製備固體斜麵培養基時，則應趁熱將試管斜放在桌上，上麵蓋上報紙以免落灰塵，冷卻後便可收起。

8、最後將高壓滅菌器內的剩餘水排出。

9、觀察滅菌效果。把滅菌培養基放入25℃溫箱中，培養48小時觀察滅菌效果。 48小時後不見雜菌生出，便證明培養基已達到滅菌目的，可以使用。

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