細菌α-澱粉酶產生菌種篩選

一．實驗目的
   1．掌握從環境中采集樣品並從中分離純化某種微生物的完整操作步驟。
   2．鞏固以前所學的微生物學實驗技術。
   3．學習澱粉酶活性的測定方法。

二. 實驗原理
α-澱粉酶是一種液化型澱粉酶，它的產生菌芽孢杆菌，廣泛分布於自然界，尤其是在含有澱粉類物質的土壤等樣品中。
    從自然界篩選菌種的具體做法，大致可以分成以下四個步驟：采樣、增殖培養、純種分離和性能測定。
    1、采樣：即采集含菌的樣品
    采集含菌樣品前應調查研究一下自己打算篩選的微生物在哪些地方分布最多，然後才可著手做各項具體工作。在土壤中幾乎各種微生物都可以找到，因而土壤可說是微生物的大本營。在土壤中，數量最多的當推細菌，其次是放線菌，第三黴菌，酵母菌最少。除土壤以外，其他各類物體上都有相應的占優勢生長的微生物。例如枯枝、爛葉、腐土和朽木中纖維素分解菌較多，廚房土壤、麵粉加工廠和菜園土壤中澱粉的分解菌較多，果實、蜜餞表麵酵母菌較多；蔬菜牛奶中乳酸菌較多，油田、煉油廠附近的土壤中石油分解菌較多等。
2、增殖培養（又稱豐富培養）
增殖培養就是在所采集的土壤等含菌樣品中加入某些物質，並創造一些有利於待分離微生物生長的其他條件，使能分解利用這類物質的微生物大量繁殖，從而便於我們從其中分離到這類微生物。因此，增殖培養事實上是選擇性培養基的一種實際應用。
3、純種分離
在生產實踐中，一般都應用純種微生物進行生產。通過上述的增殖培養隻能說我們要分離的微生物從數量上的劣勢轉變為優勢，從而提高了篩選的效率，但是要得到純種微生物就必須進行純種分離。純種分離的方法很多，主要有：平板劃線分離法、稀釋分離法、單孢子或單細胞分離法、菌絲尖端切割法等。
4、性能測定
分離得到純種這隻是選種工作的第一步。所分得的純種是否具有生產上所要求的性能，還必須要進行性能測定後才能決定取舍。性能測定的方法分初篩和複篩兩種。
初篩一般在培養皿上根據選擇性培養基的原理進行。例如要測定澱粉酶的活力可以把斜麵上各個菌株一一點種在含有澱粉的培養基表麵，經過培養後測定透明圈與菌落直徑的比值大小來衡量澱粉酶活力的高低。
複篩是在初篩的基礎上做比較精細的測定。一般是將微生物培養在三角瓶中作搖瓶培養，然後對培養液進行分析測定。在搖瓶培養中，微生物得到充分的空氣，在培養液中分布均勻，因此和發酵罐的條件比較接近，這樣，測得的結果更具有實際的意義。

三．實驗材料
1、小鐵鏟和無菌紙或袋。
2、無菌水三角瓶（300mL的瓶裝水至99mL，內有玻璃珠若幹）
3、無菌吸管（1mL，5 mL等）
4、無菌水試管（每支4.5mL水）
    5、無菌培養皿 
    6、分離培養基 
       蛋白腖 1%； NaCl  0.5%； 牛肉膏 0.5%； 可溶性澱粉 0.2%；瓊脂1.5%；pH7.2；水定容。
       注：先將可溶性澱粉加少量蒸餾水調成糊狀，再加到溶化好的培養基中，調勻。
7、Lugol氏碘液：碘1克，碘化鉀2克，水300毫升
   配製時先將碘化鉀溶於5-10毫升水中，再加入碘，溶解後定容。
    8、麩曲培養基：
  麩皮  7克；  玉米麵  1克； (NH4)2SO4  0.04克 (4%(NH4)2SO4加1mL)；
  NaOH  0.08克(8%NaOH加lmL)；
      水  10mL，混合均勻，裝入250-300mL三角瓶中，15磅滅菌30分鍾。
9、碘原液：
       碘  2.2%；    碘化鉀  0.4%；    加水定容。
10、標準稀碘液 
    取碘原液15mL，加碘化鉀8克，水定容200mL。
    11、比色稀碘液 
       取原碘液2mL，加碘化鉀20mg，定容至500mL。
    12、0.2%可溶性澱粉液
       稱取0.2克可溶性澱粉，先以少許蒸餾水混合，再徐徐傾入煮沸蒸餾永中，繼續煮沸
        2分鍾，冷卻，加水至100mL。
    13、磷酸氫二鈉--檸檬酸緩衝液pH6.0。
        稱取Na2HPO4•12H20  11.31克，檸檬酸  2.02克，加水定容至250mL。
14、標準糊精液
    稱取0.3克糊精，懸浮於少量水中，再傾入400mL沸水中，冷卻後，加水稀釋至500mL。 
    冰箱存放。