環境中微生物的檢測（2）

1.2水體中的微生物

水體可分為天然水體和人工水體。天然水體包括海洋、江河、湖泊等；人工水體包括水庫、運河、城市排水係統、各種汙水處理係統等。水體中含有微生物所需的各種營養，因而也是微生物的天然生境。水體中微生物除天然棲息者外，還有來自土壤、空氣、動植物殘體、動物排泄物、各類工業廢水和生活汙水中的微生物，其中包括某些病原微生物。

1.2.1水中微生物的種類、分布

由於各水域中營養物質的組成、濃度、水溫、溶解氧的差異及微生物的來源不同，因此其種類、數量差異很大。

1.2.1.1 微生物的種類

（1）清水型水生微生物

在潔淨的水域中，因營養物較少，微生物數量也較少。在每毫升水中一般隻含幾十個到幾百個細菌，並以自養型種類為主。常見的細菌有綠硫細菌、紫色細菌、藍細菌、柄細菌、赫色纖毛菌、球衣細菌和螢光假單胞菌等。此外，還有許多藻類（如絲狀綠藻、矽藻等）、真菌（水黴菌屬和綿黴菌屬）、原生動物（如鍾蟲及其他固著型纖毛蟲等）和後生動物（如枝角類、橈足類等）。

（2）腐敗型水生微生物

在受到有機物嚴重汙染的水域中，數量較多的是細菌，每毫升水中可達幾千萬個甚至幾億個，以異養菌為優勢。異養菌分解有機物，起重要的淨化作用。常見的微生物中，細菌以變形杆菌、產氣腸杆菌、產氣堿杆菌、等革蘭氏陰性無芽孢菌為主，此外還有芽孢杆菌、生孢梭菌、大腸杆菌、糞鏈球菌、弧菌、螺菌、假單胞菌，有的甚至還含有傷寒、痢疾、霍亂等病原體；藻類有綠藻、裸藻等；原生動物有草履蟲、屋滴蟲、小口鍾蟲等。

1.2.1.2 微生物的分布

影響微生物在水體中分布的因素有：水體類型、汙染程度、有機物的含量、溶解氧量、水溫、pH及水深等。

微生物在水體中的水平分布規律為：近岸水域中細菌數量較多，離岸越遠的地方，微生物越少；底泥中的細菌多於水中的細菌。

微生物在較深較大的靜水水域中的垂直分布規律是：在上層水體中（水麵下0~10m深處），氧含量較高，主要有好氧細菌（如假單脆菌、柄杆菌、球衣細菌等）、真菌和藻類；中層水體（水深20~30m）主要有光合細菌（如紅硫細菌和綠硫細菌）以及厭氧細菌；底層水體中（30m以下及湖底泥），主要有脫硫弧菌屬、甲烷杆菌屬和甲烷球菌屬等厭氧細菌。微生物的數量以5~10m深處為最多，隨著深度的增加而減少。

地下水由於經過土壤過濾、有機物缺乏，故含菌量遠遠少於地麵水，在深層地下水中甚至沒有細菌。

1.2.2 水的細菌學檢測

1.2.2.1 細菌總數（CFU）的測定

細菌總數是將定量水樣（原水樣或作一定稀釋後水樣1mL）接種在普通營養瓊脂培養基內，於37℃培養24h後觀察結果，計數其上長出的細菌菌落數，然後換算求出原水樣每mL中所含的細菌數。

其測定步驟和土壤中微生物的分離計數方法基本相同，但須注意：①水樣是用無菌采樣瓶直接采取水樣；②水樣接種於營養瓊脂培養基中，在37℃下培養24h；

在37℃營養瓊脂培養基中能生長的細菌，代表在人體溫度下能繁殖的異養型細菌。細菌總數越多，說明水被有機物或糞便汙染越重，被病原菌汙染的可能性也越大。

在生活飲用水中所測得的細菌總數，除說明水被生活廢棄物汙染的程度外，還可指示該水能否飲用。可在生活飲用水進行衛生學評價時提供依據。

我國生活飲用水標準（GB5749-85）規定，細菌總數不得超過100個/ml。

一般認為在天然水體中，如10～100個/mL，為極清潔的水；100～1000個/mL，為清潔的水；1000～10000個/mL，為不太清潔的水；10000～100000個/mL，為不清潔的水；大於100000個/mL，為極不清潔的水。

1.2.2.2 大腸菌群的測定

天然水體的細菌性汙染主要源於生活汙水中的糞便，即水中的病原菌很可能是腸道傳染病的病原。通常情況下，水中病原菌的含量極少，而細菌種類卻很多，需要耗費大量的人力、物力及複雜的分離培養技術，才能將病原菌一一檢測出來。最常見的數量極大的大腸菌群與病原菌同樣來自於動物糞便，根據這一點，隻要通過檢查水樣中的指示菌――大腸菌群，即可知道該水體被糞便汙染的程度，從而間接推測其他病原菌存在的概率。

大腸菌群是指那些能在37℃下，24~48h之內使乳糖發酵並產酸產氣、好氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢杆菌。主要包括大腸埃希氏菌、產氣杆菌、枸櫞酸鹽杆菌、副大腸杆菌。

大腸埃希氏菌即大腸杆菌是人和溫血動物腸道中的正常細菌，兼性好氧的革蘭氏陰性、無芽孢、兩頭鈍圓的杆菌，大小0.5~0.8mm×2.0~3.0mm；最適溫度37℃，最適的pH為中性；能分解葡萄糖、甘露醇、乳糖等多種碳水化合物，並產酸產氣。大腸菌群的各類細菌的生理習性都相似，隻是副大腸杆菌不分解或緩慢分解乳糖。在遠滕氏培養基（品紅亞硫酸鈉培養基）或伊紅美藍培養基表麵會形成具有特殊現象的菌落，大腸埃希氏杆菌的菌落呈紫紅色帶金屬光澤；枸櫞酸鹽杆菌的菌落呈紫紅或深紅色；產氣杆菌的菌落呈淡紅色，中心色深；副大腸杆菌的菌落則無色透明。這些現象可作為鑒別的依據。

大腸菌群的檢驗方法有發酵法和濾膜法。發酵法是測定大腸菌群的基本方法，包括初發酵試驗、平板分離和複發酵試驗三個部分。

（1）初發酵試驗

發酵管內裝有乳糖蛋白腖液體培養基，並倒置一小倒管。乳糖能起選擇作用，因為很多細菌不能發酵乳糖，而大腸菌群能發酵乳糖並產酸產氣。為便於觀察細菌的產酸情況，培養基內加有溴甲酚紫作為pH指示劑。細菌產酸後，培養基即由原來的紫色變為黃色，溴甲酚紫還能抑製其他細菌如有芽胞的細菌生長。

水樣接種於發酵管內，37℃下培養，24h內小倒管中有氣體形成，並且培養基混濁，顏色黃，說明水中存在大腸菌群，為陽性結果。對於隻產酸不產氣的，不能說明是陰性結果，因為在菌量少的情況下，可能延遲至48h後才產氣，此時應視為可疑結果。需繼續做下麵兩部分實驗，才能確定是否是大腸菌群。既不產酸又不產氣的，為陰性結果。

（2）平板分離

平板培養基一般使用遠藤氏培養基或伊紅美藍瓊脂培養基，前者含有堿性品紅染料，在此作為指示劑，它可被培養基中的亞硫酸鈉脫色，使培養基呈淡粉紅色，大腸菌群發酵乳糖後產生的酸和乙醛立即與品紅反應，形成深紅色複合物，使大腸菌群菌落變為帶金屬光澤的深紅色。亞硫酸鈉還可抑製其他雜菌的生長。伊紅美藍瓊脂培養基則含有伊紅與美藍染料，在此亦作為指示劑，大腸菌群發酵乳糖造成酸性環境時，該兩種染料即結合成複合物，使大腸菌群產生與遠藤氏培養基上相似的、帶核心的、有金屬光澤的深紫色菌落。

將培養24h後產酸產氣或隻產酸的發酵管，分別劃線接種在平板上。經過37℃培養24h，挑取典型的大腸菌群菌落，進行革蘭氏染色，鏡驗後若呈陰性，則可認為有此類細菌存在。為了更進一步驗證，可做下一步實驗。

（3）複發酵實驗

將染色為革蘭氏陰性、無芽胞杆菌的菌落再移植於乳糖培養基中，原理與初發酵試驗相同，經24h培養產酸又產氣的，最後確定為大腸菌群陽性結果。

根據發酵陽性管的數量，以確定大腸菌群數。

除查表外，也可以用計算法求出大腸菌群數。即根據初發酵的發酵管數、大腸菌群陽性管數及檢測水樣量，利用數理統計原理，計算出每升水樣中大腸菌群的最近似數（MPN）。

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