菌種保存和微生物常識

菌種保存和微生物常識
1、常用培養基的製備、滅菌與消毒
營養：從外部環境攝取其生命活動所必需的能量和物質，滿足生長和繁殖需要的一種生理過程。是生命活動的物質基礎，是生命活動的起點。
營養物：具有營養功能的物質。也包括光能。提供生物的結構物質、能量、代謝調節物質和良好的生理環境。
營養要素：碳源、氮源、能源、生長因子、無機鹽和水
培養基：人工配製、適合微生物生長繁殖或產生代謝產物的混合養料。要求：應具備6大營養要素；物質比例合適；必須滅菌。
2、選用和設計培養基的原則、方法及製備過程
原則：目的明確 、營養協調、經濟節約
  物理化學條件適宜
方法：生態模擬、查閱文獻
  精心設計、試驗比較
步驟：稱量、熔化、調PH、過濾、分裝、
  加塞、包紮、滅菌、冷卻、無菌檢查
培養基種類：
一、按成分的不同分
天然培養基、合成培養基、半合成培養基
二、按培養基的物理狀態分
固體培養基、液體培養基、半固體培養基
三、按培養基用途
基礎培養基、選擇培養基 、加富培養基鑒別培養基

消毒與滅菌 ：
消毒：消滅病原菌和有害微生物的營養體
滅菌：殺滅一切微生物的營養體，芽胞和孢子。
方法：
一、物理的方法：加熱、過濾、輻射
二、化學的方法：用化學試劑抑製或殺滅微生物。主要破壞細菌代謝機能。如重金屬離子，磺胺類藥物及抗生素等。

加熱法：
（1）幹熱法：火焰灼燒滅菌和熱空氣滅菌。
1、火焰灼燒適用於接種環、接種針和金屬用具如鑷子等，試管口和瓶口，塗布用玻璃棒。
2、熱空氣滅菌利用高溫幹燥空氣（160－170C）加熱滅菌1－2h，適用於玻璃器皿和培養皿等。原理加熱使蛋白質變性，與水的含量有關，當環境和細胞含水量越大，凝固越快。
3、注意事項：
1）培養基、橡膠製品、塑料製品不能用此法；
2）溫度控製在<180°；
3）物品不能太擠；
4）溫度降至70°時才開箱門。
（2）濕熱法 ：原理：因為濕熱中菌體吸水，蛋白質容易凝固，因蛋白質含水量增加，所需凝固溫度降低；濕熱的蒸氣有潛熱存在。所以效果比同溫度下幹熱好。
高壓蒸汽滅菌法：
1、設備：高壓滅菌鍋
2、時間長短根據滅菌物品的種類和數量不同有所變化。
3、適用於培養基、工作服、橡膠物品等的滅菌，也可用於玻璃器皿的滅菌。
4、注意事項：
1）冷空氣徹底排除；2）加水；3）壓力降為“0”時方可打開。
常壓蒸汽滅菌：對於不宜用高壓蒸汽滅菌的培養基如明膠培養基、牛乳培養基，含糖培養基等可采用此法。徹底滅菌則采用間歇滅菌方法。
煮沸滅菌法：適用注射器和解剖器皿，時間10－15min，
超高溫殺菌:135-150°C和2-8s對牛乳和其它液態食品。優點 ：保持食品價值和營養成分。
過濾除菌：
原理：介質在有壓力時阻隔微生物。
適用範圍：許多材料如血清、抗生素及糖溶液采用此法。
設備：蔡氏過濾器，濾膜過濾器。
優缺點：不破壞培養基成分，隻適用少量濾液。需 大量無菌空氣以及淨化工作台。    
注意事項：1、壓力適當；
  2、無菌條件下進行；
  3、防止滲透現象。

原理：應用化學製劑破壞細菌代謝機能。
殺菌劑如重金屬離子；
抑菌劑如磺胺類及多數抗生素。
注意：與藥品的濃度高低，時間長短，微生物種類以及微生物所處的環境有關。
常用化學殺菌劑有：乙醇、醋酸、石碳酸
福爾馬林、升汞、高錳酸鉀、新潔爾滅等

3、微生物的分離、純化及培養技術
分離與純化：從混雜的微生物群體中獲得隻含某一種或某一株微生物的過程。
為什麽要進行純培養：平板上的單一菌落並不一定保證是一種菌。
常用的分離、純化方法：
單細胞挑取法   稀釋塗布平板法
稀釋混合平板法   平板劃線法
稀釋塗布平板法 ：
步驟：  
1、倒平板： 牛肉膏蛋白腖培養基，高氏I號培養基，查氏培養基冷卻至55-60℃時，混勻後倒平板，牛肉膏蛋白腖培養基倒4皿，高氏I號培養基和查氏培養基各倒3皿。
2、製備汙水稀釋液：10g土樣，加入90ml無菌水中，在三角瓶中振搖20min。取0.5ml 加入盛有4.5ml無菌水的試管中，以此類推，製成不同稀釋度。
3、塗布：將上述每種培養基平板底麵標記稀釋度，然後用無菌吸管從最後三種稀釋度，即10-4、10-5和10-6的試管中吸取0.1ml對號放入平板上，用玻棒塗布。
4、培養：高氏I號和查氏倒置培養於28℃培養箱中培養3-5days，牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基在37℃培養1-2days。
5、挑菌落：轉至斜麵，檢查是否一致，保存。
平板劃線法：
1、倒平板，標記培養基名稱，編號和實驗日期。
2、劃線方法

4、微生物培養技術
1、斜麵接種
2、液體培養基接種
3、穿刺接種
4、將已接種的斜麵、半固體和液體培養   基放置培養箱中培養
5、將生長好的菌種用牛皮紙包好，置4℃冰箱中保存。
幾種常用的保藏方法：
1、傳代培養法
保藏的菌種通過斜麵、穿刺或皰肉培養基（用於厭氧細菌）培養好後，置4C˚冰箱中存放，定期進行傳代培養、再存放。
可用膠塞代替棉塞或在斜麵上覆蓋一層無菌液體石蠟來進一步延長保存期。
2、載體法
使生長合適的微生物吸附在一定的載體上進行幹燥。
常用的載體有土壤、砂土、矽膠、明膠、麩皮、磁珠和濾紙片等。
3、懸液法
將細菌、酵母菌細胞懸浮在一定的溶液中保存。
溶液包括蒸餾水、糖溶液、磷酸緩衝液、食鹽水等。

4、冷凍法
使菌種始終存放在低溫環境下的保藏方法。包括低溫法和液氮法。
此法關鍵是要克服細胞的冷凍損傷。注意控製降溫速率及保護劑的使用。
5、真空幹燥法
這類方法包括冷凍真空幹燥法和L－幹燥法。
冷凍真空幹燥法是將要保藏的微生物樣品先經低溫預凍，然後在低溫狀態下進行減壓幹燥。
L-幹燥法則不需要低溫預凍樣品，隻是使樣品維持在10－20C˚範圍內進行真空幹燥。
操作方法
1、斜麵保藏法
將菌種轉接在適宜固體斜麵培養基上，待其充分生長後，用牛皮紙將棉塞部分包紮好（棉塞換成膠塞效果更好），置4C˚冰箱中包藏。
保藏時間依微生物的種類而定。黴菌、放線菌及芽孢菌保存2－4個月移種一次，酵母菌間隔兩個月，普通細菌一個月，假單胞菌兩周傳代一次。
此法優點是操作簡單、使用方便，缺點是保藏時間短、易被汙染。
2、液體石蠟保藏法
將無菌石蠟加在已長好菌的斜麵上，其用量以高出斜麵頂端1CM為準，使菌種與空氣隔絕。
將試管直立，置低溫或室溫下保存。
此法實用且效果較好。黴菌、放線菌、芽孢菌可保藏兩年以上，酵母菌可保藏1－2年，普通細菌也可保藏1年左右。
3、穿刺保藏法
按穿刺接種方式培養菌種，菌種長好後用膠塞封嚴，置4℃冰箱存放。

4、砂土管保藏法

(1)河砂處理
取河砂若幹加入鹽酸10% ，加熱煮沸30min除去有機機質。倒去鹽酸溶液，用自來水衝洗至中性，最後一次用蒸鎦水衝洗，烘幹後用40目篩子過篩，棄去粗顆粒，備用。
(2)土壤處理　
取非耕作層不含腐殖質的痩黃土或紅土，加自來水浸泡洗滌數次，直至中性。烘幹後碾碎，用100目篩子過篩，粗顆粒部分丟掉。
(3)砂土混合  
處理妥當的河砂與土壤按3：1的比例摻合(或根據需要而用其他比例，甚至可全部作砂或土)均勻後，裝入10x100mm的小試管或安瓿管中，每管分裝1g左右，塞上棉塞，進行滅菌(通常采用間歇滅菌2--3次)，最後烘幹。
(4)無菌檢查  
每10支砂土管隨機抽1支，將砂土倒入肉湯培養基中，30℃培養40h，若發現有微生物生長，所有砂土管則需重新滅菌，再作無菌試驗，直至證明無菌後方可使用。
(5)菌懸液的製備  
取生長健壯的新鮮斜麵菌種，加入2-3ml無菌水(每18x180mm 的試管斜麵菌種)，用接種環輕輕將菌苔洗下，製成菌懸液。
(6)分裝樣品  
每支砂土管(注明標記後)加入0．5ml菌懸液(剛剛使砂土潤濕為宜)， 用接種針拌勻。
(7)幹燥  
將裝有菌懸液的砂土管放入幹燥器內，幹燥器底部盛有幹燥劑。用真空泵抽幹水分後火焰封口(也可用橡皮塞或棉塞塞住試管口)。
(8)保存  
置4℃冰箱或室溫幹燥處，每隔一定的時間進行檢測。此法多用於產芽孢的細菌、產生孢子的黴菌和放線菌。在抗生素工業生產中應用廣泛、效果較好，可保存幾年時間，但對營養細胞效果不佳。
5、冷凍真空幹燥法
（1）凍幹管的準備：中性硬製玻璃，烘幹，滅菌。
（2）菌種培養：細菌芽孢脫落；放，黴孢子豐滿。
（3）保護劑的配製：配製，滅菌，檢查。
（4）菌懸液的製備：2-3ml保護劑。
（5）分裝樣品：菌懸液每管0.2ml。
（6）預凍：程序控溫儀降溫。
（7）冷凍真空幹燥：-50℃下抽真空。
（8）取出樣品：輕敲鬆散即達標。
（9）第二次幹燥。
（10）熔封。
（11）存活性檢測：抽取一管進行存活性檢查。
（12）保存：4℃保存。