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沙門氏菌檢驗(4)



錄入時間:2010-9-20 8:22:01 來源:青島betway必威西汉姆联

三、培養基

  (一)緩衝蛋白腖水
成分:蛋白腖             10g
氯化鈉             5g
   磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)  9g
   磷酸二氫鉀           1.5g
   蒸餾水             1000mL
pH7.2
按上述成分配好後,裝入大燒瓶,121℃高壓滅菌,臨用時無菌分裝每瓶225mL,供沙門氏菌前增菌用。
(二)氯化鎂孔雀綠(MM)增菌液
成分:甲液:胰蛋白腖         5g
      氯化鈉          8g
      磷酸二氫鉀        1.6g
      蒸餾水          1000mL
   乙液:氯化鎂(化學純)      40g
      蒸餾水          100mL
   丙液:0.4%孔雀綠水溶液
製法:分別按上述成分配好,121℃高壓滅菌15min備用,臨用時取甲液90mL,乙液9mL,丙液0.9mL,以無菌操作混合即可。
(三)四硫磺酸鈉煌綠(TTB)增菌液
成分:多腖或月示腖         5g
   膽鹽              1g
   碳酸鈣             10g
   硫代硫酸鈉           30g
   蒸餾水             1 000mL
製法:將上述各成分加入蒸餾水,加熱溶解,分裝每瓶100mL中加入碘溶液2mL0.1%煌綠溶液1mL
碘溶液配製:碘6g,碘化鉀5g,蒸餾水20mL
(四)亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液
成分:蛋白腖           5g
   乳糖            4g
   亞硒酸氫鈉          4g
磷酸氫二鈉         5.5g
   磷酸二氫鉀         4.5g
   L-胱氨酸          0.01g
   蒸餾水           1 000mL
製法:將除亞硒酸氫鈉和L-胱氨酸以外的各成分溶解於900mL蒸餾水中,加熱煮沸,俟冷備用,另將亞硒酸氫鈉溶解於100mL蒸餾水中,加熱煮沸,俟冷,以無菌操作與上液混合。再加入1L~胱氨酸~氫氧化鈉溶液1mL。分裝於滅菌瓶中,每瓶100mLpH應為7.0±0.1
1
L-胱氨酸-氫氧化鈉溶液的配法:稱取L-胱氨酸0.1g(或DL-胱氨酸0.2g),加1N氫氧化鈉1.5mL,使溶解,再加入蒸餾水8.5mL即成。
(五)亞硫酸鉍瓊脂(BS
成分:蛋白腖        10g
牛肉膏        5g
葡萄糖        5g
   硫酸亞鐵       0.3g
   磷酸氫二鈉      4g
   煌綠         0.025g
   檸檬酸鉍銨      2g
   亞硫酸鈉       6g
瓊脂 18~20g
   蒸餾水        1000mL
pH7.5
製法:將前5種成分溶解於300mL蒸餾水中,將檸檬酸鉍銨和亞硫酸鈉另用50mL蒸餾水溶解,將瓊脂於600mL蒸餾水中煮沸溶解,冷至80℃,將以上三液合並,補充蒸餾水至1000mL,校正pH,加0.5%煌綠水溶液5mL搖勻,冷至50~55℃傾注平板。
注:此培養基不需高壓滅菌,製備過程中不宜過分加熱,以免降低其選擇性,應在臨用前一天製備,貯存於室溫暗處,超過48h,不宜使用。
(六)DHL瓊脂(Deoxycholate Hydrogen Sulfide Lactose Agar
成分:蛋白腖           20g
   牛肉膏           3g
   乳糖            10g
蔗糖            10g
去氧膽酸鈉         1g
   硫代硫酸鈉         2.3g
   檸檬酸鈉          1g
檸檬酸鐵銨         1g
   中性紅           0.03g
   瓊脂            18~20g
   蒸餾水           1000mL
製法:除中性紅和瓊脂以外的成分溶解於400mL蒸餾水中,校正pH7.3,再將瓊脂於600mL蒸餾水中煮沸溶解,兩液合並,加入0.5%中性紅水溶液6mL,待冷至50~55℃傾注平板。
(七)HE瓊脂(Hektoen Enteric Agar
成分:月示腖            12g
   牛肉膏             3g
   乳糖              12g
   蔗糖             12g
   水楊素 2g
   膽鹽 20g
   氯化鈉 5g
   瓊脂              18~20g
   蒸餾水             1000mL
   0.4%溴麝香草酚藍溶液     16mL
   Andrade指示劑         20mL
 甲液              20mL
乙液              20mL
pH7.5
製法:將前7種成分溶解於400mL蒸餾水內為基礎液,將瓊脂加入於60mL蒸餾水內,加熱溶解,加入甲液和乙液於基礎液內,校正pH,再加入指示劑,並與瓊脂合並,待冷至50~55℃傾注平板。
注:此培養基不可高壓滅菌。
  甲液的配製:
   硫代硫酸鈉     34g
   檸檬酸鐵銨     4g
   蒸餾水       100mL
  乙液的配製:
   去氧膽酸鈉     10g
   蒸餾水       100mL
  ④Andrade指示劑:
   酸性複紅       0.5g
1N
氫氧化鈉溶液   16mL
   蒸餾水       100mL
將複紅溶解於蒸餾水中,加入氫氧化鈉溶液,數小時後中複紅褪色不全,再加氫氧化鈉溶液1~2mL
(八)SS瓊脂
1.
基礎培養基
成分:牛肉膏         5g
   月示腖        5g
   三號膽鹽        3.5g
   瓊脂          17g
   蒸餾水         1000mL
製法:將牛肉膏、月示 腖和膽鹽溶解於400mL蒸餾水中,將瓊脂加入於600mL蒸餾水中,煮沸,使其溶解,再將兩液混合,121℃高壓滅菌15min,保存備用。
2.
完全培養基
成分:基礎培養基       1000mL
   乳糖          10g
   檸檬酸鈉        8.5g
   硫代硫酸鈉       8.5g
   10%檸檬酸鐵溶液    10mL
   1%中性紅溶液      2.5mL
0.1
%煌綠溶液      0.33mL
製法:加熱溶化基礎培養基,按比例加入上述染料以外的各成分,充分混合均勻,校正pH7.0,加入中性紅和煌綠溶液,傾注平板。
注:製好的培養基宜當日使用,或保存冰箱內於48h內使用。
  煌綠溶液配好後應在10d以內使用。
  可以購用SS瓊脂的幹燥培養基。
(九)三糖鐵瓊脂
成分:蛋白腖:         20g
   牛肉膏          5g
乳糖           10g
蔗糖           10g
   葡萄糖          1g
   氯化鈉          5g
   硫酸亞鐵銨[FeNH42SO42·6H2O]0.2g
   硫代硫酸鈉           0.2g
   瓊脂              12g
   酚紅              0.025g
   蒸餾水             1000mL
pH7.4
製法:將除瓊脂和酚紅以外的各成分溶解於蒸餾水中,校正pH,加入瓊脂煮沸溶化,加入0.2%酚紅水溶液12.5mL,搖勻,分裝試管,121℃高壓滅菌15min,放置高層斜麵備用。
(十)蛋白腖水(靛基質試驗用)
萬分:蛋白腖(或胰蛋白腖)      20g
   氯化鈉             5g
   蒸餾水             1000mL
pH7.4
製法:按上述成分配製,分裝小試管,121℃高壓滅菌15min
靛基質試劑:
 柯凡克試劑:將5g對二甲氨基苯甲醛溶於75mL戊醇中,然後緩慢加入濃鹽酸25mL
-波試劑:將1g對二甲氨基苯甲醛溶解於95mL95%酒精內,然後緩慢加入濃鹽酸20mL
試驗方法:接種培養物36±1℃培養1~2d,加柯凡克試劑約0.5mL,輕搖試管,陽性者於試劑層呈深紅色。或加歐-波試劑約0.5mL,沿管壁下覆蓋於培養基表麵,陽性者於液麵接觸處呈玫瑰紅色。
注:蛋白腖中應含有豐富的色氨酸,每批蛋白腖應先用已知菌種鑒定後方可使用。
(十一)尿素瓊脂(pH7.2
成分:蛋白腖        1g
   氯化鈉        5g
   葡萄糖        1g
   磷酸二氫鉀      2g
   0.4%酚紅溶液     3mL
   瓊脂         20g
   蒸餾水        1000mL
   20%尿素溶液     100mL
pH7.2
製法:將除尿素和瓊脂以外的成分配好,校正pH,加入瓊脂煮沸溶化,分裝燒瓶,121℃高壓滅菌15min,冷至50~55℃加入經除菌過濾的尿素溶液,分裝於滅菌試管內,放成斜麵備用。
試驗方法:接種培養物36±1℃培養24h,觀察結果,尿素酶陽性者,由於產堿而使培養基變為紅色。
(十二)氰化鉀(KCN)培養基
成分:蛋白腖         10g
氯化鈉         5g
   磷酸二氫鉀       0.225g
磷酸氫二鈉 5.64g
   蒸餾水         1000mL
   0.5%氰化鉀溶液    20mL
           pH7.6
製法:將除氰化鉀以外的成分配好,分裝燒瓶,121℃高壓滅菌15min,放在冰箱內使用其充分冷卻,每100mL培養基加入0.5%氰化鉀溶液2mL(最後濃度為1:10000),分裝滅菌試管,每管約4mL,立刻用滅菌橡皮塞塞緊,放4℃冰箱保存,同時將不加氰化鉀的培養基作為對照培養基,分裝試管備用。
(十三)氨基酸脫羧酶試驗培養基
成分:蛋白腖           5g
酵母浸膏          3g
   葡萄糖 1g
蒸餾水           1000mL
   1.6%溴甲酚紫乙醇溶液    1mL
   L-氨基酸或DL氨基酸     0.51g/100mL
製法:除氨基酸以外的成分加熱溶解後,分裝每瓶100mL,分別加入各種氨基酸:賴氨酸、精氨酸和鳥氨酸。L-氨基酸按0.5%加入,DL-氨基酸按1%加入,校正pH6.8,對照培養基不加氨基酸,分裝於滅菌的小試管內,每管0.5mL,上麵加一層液體石蠟,115℃高壓滅菌10min
試驗方法:接種培養物於36±1℃培養18~24h,觀察結果,氨基酸脫羧酶陽性者,由於產堿培養基應呈綠色,陰性者無堿性產物,但因葡萄糖產酸而使培養基變為黃色,對照管應為黃色。
(十四)糖發酵管
成分:牛肉膏          5g
   蛋白腖          10g
   氯化鈉          3g
磷酸氫二鈉        2g
   0.2%溴麝香草酚藍溶液   12mL
   蒸餾水          1000mL
            pH7.4
製法:葡萄糖發酵管按上述成分配好後,按0.5%加入葡萄糖,分裝於有倒管的試管內,121℃高壓滅菌15min。其他各種糖發酵管,可按上述成分配好後分裝好後分裝每瓶100mL121℃高壓滅菌15min,另將各種糖類分別配成10%溶液,同時高壓滅菌,將5mL糖溶液加入於100mL培養基內,以無菌操作分裝小試管。
注:蔗糖不純,加熱後會自行水解者,應采用過濾法除菌。
(十五)ONPG培養基
成分:鄰硝基酚β-D半乳糖苷(O~nitrophenyl
   β-D-galactopyranoside ONPG)    60mg
   0.01mol/L磷酸鈉緩衝液(pH7.5)   10mL
   1%蛋白腖水(pH7.5)        30mL
製法:將ONPG溶於緩衝液內,加入蛋白腖水,以過濾法除菌,分裝試管,每管0.5mL,用橡皮塞塞緊。
試驗方法:由瓊脂斜麵上挑取培養物1滿環接種,於36±1℃培養1-3h24h觀察結果,如果β-半乳糖苷酶產生,由於1-3h變黃色,如無此酶則24h不變色。
(十六)半固體瓊脂
成分:蛋白腖          1g
   牛肉膏          0.3g
   氯化鈉          0.5g
   瓊脂           0.35~0.4g
   蒸餾水          100mL
製法:按上述成分配好,煮沸溶解,校pH7.4,分裝小試管,121℃高壓滅菌15min,直立疑固備用。
(十七)緩衝葡萄糖蛋白腖水(MRV-P試驗用)
成分:磷酸氫二鉀        5g
   多腖           7g
   葡萄糖          5g
   蒸餾水          1000mL
           pH7.0
製法:溶化後校正pH,分裝試管,每管1~2mL121℃高壓滅菌15min
甲基紅試驗:接種培養物於36±1℃培養2~4天,滴加試劑一滴,立即觀察結果,鮮紅色為陽性,黃色為陰性。
甲基紅試劑配法:10mg甲基紅溶於30mL乙醇中,然後加入20mL蒸餾水。
V-P
試驗:接種培養物於36±1℃培養2~4天,加入6α-萘酚酒精溶液0.5mL40%氫氧化鉀溶液0.2mL,充分振搖觀察結果,陽性者立刻或數分鍾呈紅色,如陰性時應於36℃培養4h再進行觀察。
(十八)丙二酸鈉培養基
成分:酵母膏          1g
   硫酸銨          2g
   磷酸氫二鉀        0.6g
   磷酸二氫鉀        0.4g
   氯化鈉          2g
   丙二酸鈉         3g
   0.2%溴麝香草酚藍溶液   12mL
   蒸餾水          1000mL
            pH6.8
製法:先將酵母浸膏和鹽類溶解於水,校正pH後再加指示劑,分裝試管,121℃高壓滅菌15min
接種培養物於36±1℃培養48h,陽性者由綠色變為藍色。
(十九)氧化酶試驗
1
%鹽酸二甲基對苯二胺溶液:小量新鮮配製,於冰箱內避光保存。
1
α-萘酚乙醇溶液。
試驗方法:取白色潔淨濾紙沾取菌落,加鹽酸二甲基對苯二胺溶液一滴,陽性者呈現粉紅色,並逐漸加深,再加α-萘酚溶液一滴,陽性者於半分鍾內呈現鮮藍色,陰性於2min內不變。
以毛細吸管吸取試劑,直接滴加於菌落上,其顯色反應與以上相同。
(二十)WS瓊脂
成分:
  月示腖            12g
  牛肉膏              3g
  氯化鈉              5g
  乳糖               12g
  蔗糖               12g
  十二烷基硫酸鈉          2g
  瓊脂               15g
  Andrade指示劑           20mL
  0.4%溴麝香草酚藍溶液 16mL
  甲液               20mL
  蒸餾水              1000mL
              pH7.0
製法:
除指示劑和甲液外,將其他成分加熱溶解,不需消毒,校正pH後加入指示劑和甲液,傾注平板,應呈草綠色。
注:供沙門氏菌分離用。
  ②Andrade指示劑和甲液的配製均見HE瓊脂。


 

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