幾種培養基選擇性分離稀有放線菌的方法

放線菌作為新的生物活性代謝產物的主要來源早已成為人們關注的焦點。自從鏈黴菌素的發現 ， 大量抗生素從Streptomyces 和Streptovertieilliura分離得到， 例如氯黴素、氨基苷類、 四環素、 大環內酯類和頭孢黴素等…。因此，放線菌被認為是一類具有重要經濟及研究價值的微生物。長期的研究重點集中在土壤中的優勢菌鏈黴菌上。對這一類群菌的廣泛篩選， 的確發現了很多新種，而且它們能產生多種有用次生代謝產物 。然而，隨著大量生物活性物質的不斷發現，從鏈黴菌得到新的生物活性物質的幾率逐漸下降。同時，另一類菌——稀有放線菌逐漸引起了新藥開發研究者們的注意。

本文主要從分離培養基的設計角度，介紹了幾種主要的且能產生生物活性物質的稀有放線菌高選擇性分離方法。根據目的菌對各種條件的耐受範圍和有利於它們生長的條件，選擇和設計培養基的成分、 酸堿度等。 

葡萄糖—天門冬酰胺改良培養基、澱粉—甘油培養基和甘油—酪素培養基成分均能促進稀有放線菌的生長。分離培養基中加入4種抗生素抑製細菌和真菌的生長，有利於稀有放線菌分離。 

分離程序如下：沙漠土樣用溶液稀釋，溶液組成為：K₂HPO₄  0.38％ ， KH₂PO₄  0.12％ ， MgSO₄·7H₂O   0.51 ％ ，NaCl  0.25％， Fe₂ (SO₄ )₃·7 H₂O   0.005％ ， MnSO₄    0.005％。

選用3種分離培養基，分別是：

(1)葡萄糖一天門冬酰胺改良培養基： 葡萄糖 1 ％， 天門冬酰胺 0.1 ％， K₂HPO₄  0.1%， FeSO₄·7H₂O  0.0001％， MnC1₂·4 H₂O  0.0001％， ZnSO4·7H₂O  0.001％， 瓊 脂1.5％ ， pH7.0；

(2)澱粉一甘油培養基 ： 澱粉 1.0％， 甘油1.0％ ，(NH₄)₂SO₄  0.2 ％， CaCO₃  0.2％ ， KH₂PO₄   0.1％， MgSO₄·7 H₂O  0.1 ％ ， NaC1   0.1 ％， 脯氨酸 l ％ ， 瓊脂1.2％ ，pH7.0； 

(3)甘油 一酪素培養基 ：甘油 1.0％， 酪素0.03％ ，KNO₃ 0.2％ ， NaC1  0.2％ ， K₂HPO₄  0.2％ ， MgSO₄·7 H₂O  0.005％ ， FeSO₄·7 H2O  0.001％， CaCO₃   0.02％ ， 瓊脂1.8％ ， pH7.0。 

製黴菌素12.5m g／m L， 苯菌靈 20mg／mL ， 環絲氨酸 50mg／m L， 萘啶酸25 mg ／m L均加入3種分離培養基。稀釋塗布平板法分離，37℃培養 ，7 d 。

吉蘭糖膠是一種由Pseudomonas elodea產生的多糖。常用作植物組織培養的凝固基質， 有促進植物細胞生長的作用。它也能促進很多放線菌氣生菌絲的生長及氣生孢子的形成 ， 如Sporichthya ，Actinobispora ，Planobispora， Plano—monospora等。因此，可以用作稀有放線菌分離培養基的凝固基質。

通常分離產動孢的遊動放線菌， 如Planobispora ，Planomonospora等， 利用它們孢子的遊動性， 可用誘餌捕集法、化學趨化法和離心法，如Nonomura等人用花粉或角蛋白誘餌捕集法成功地分離得到Actinoplanesspp．， Pilimelia和Planomonospora  spp ．； 化學趨化法選擇性分離Actinoplanes ，Catenuloplanes和Dactylosporangium ； 離心法將動孢菌與鏈黴菌等不產動孢的放線菌分開， 選擇性分離稀有產動孢的放線菌。Suzuki介紹了一些利用吉蘭糖膠特異性分離此類放線菌的方法。 

2．1 選擇性分離 Sporichthya  Sporichthya  polymorpha在查氏瓊脂上形成的菌落小，難以辨別。而在HV吉蘭糖膠上形成的菌落大，便於快速鑒定。同樣，Sporichthya在幾丁質瓊脂(Colloidal  chitin agar )、放線菌分離瓊脂 ( Actinomyceteisolation agar ) 、蛋清瓊脂 (Egg  a lbuminagar ) 和 HV瓊脂上形成的氣生菌絲都不及HV吉蘭糖膠豐富。實驗研究表明，Ca²⁺促進Sporichthya polymorpha 生長 。Ca²⁺加入HV吉蘭糖膠以提高對Sporichthya的選擇性 。

    Suzuki等用脫脂牛奶對土樣進行預處理，可刺激Spofichthya孢子的運動。需要引起注意的是，高溫能夠破壞脫脂牛奶中的刺激因子，所以脫脂牛奶不能進行高溫滅菌。pH8.0時， 孢子運動頻率最大。嗎啉丙磺酸 ( MOPS， pH8.0 ) 有助於 Sporichthya孢子的運動，提高了分離效率。差速離心是分離動孢菌的有效分離方法之一。脫脂牛奶結合離心法提高了分離的選擇性。分離程序如下：將風幹土樣在80℃幹熱處理，l h ， 用含0.1％脫脂牛奶 (未滅菌) 的MOPS ( morpholinepropanesulfonic  acid，pH8.0) 浸液製成土壤懸液，27℃振蕩培養 1 h ，離心1000 r／m i n ，10 m i n，用無菌生理鹽水梯度稀釋後， 塗布HVG平板( CaC1₂ 2mM， 放線酮50μg／m L) ， 27℃培養，21～2 8d。 

2.2 選擇性分離  Planobispora  Planobispora通常形成棒狀孢囊，孢囊內包含一對縱生的孢子。這是Planobispora  典型的形態特征。Planobispora在一些標準分離培養基，如澱粉一硝酸鹽酪素瓊脂、 放線菌分離瓊脂和蛋清瓊脂上不能或稀疏形成孢囊。相比之下，在HSG上能夠產生豐富的孢囊。有意思的是，當Planobom菌落數超50個時，在吉蘭糖膠培養基上能夠產生豐富的孢囊，而菌落數少於20個時， 在氣絲上不能形成孢囊 。

HSG即腐殖酸微量鹽吉蘭糖膠。其中微量鹽包括FeSO₄·7H₂O，MnCl₂·4H₂O，ZnSO4·7H₂ O，NiSO₄·6 H₂O。它們在低濃度情況下，可以促進孢囊的形成。在高濃度條件下，卻抑製孢囊的形成。堿性條件增加了有機物質的降解，利於產孢囊的動孢菌生長。pH 9.0比中性pH更利於Planobispora孢囊的形成。同時，堿性條件也可以抑製優勢菌鏈黴菌的生長，提高對Planobispora的分離效果。當培養溫度為 32～37℃時，不利於非目的菌的生長，而對Planobispora的生長卻不構成影響。Suzuki等采用32℃培養，以減少水分的蒸發， 同樣達到選擇性分離的效果。

分離程序如下：風幹土樣在90℃幹熱處理，1h ， 用CHES ( 5mM  pH9.0 ) ，脫脂牛奶0.1％ ， 吐溫80  0.01％， 三甲氧苄二氨嘧啶 100μg／mL和萘啶酸100μg／mL 製成土壤懸液 ，35℃振蕩l h ，離心1000g，10min ，用無菌生理鹽水梯度稀釋後，塗布HSG平板(三甲氧苄二氨嘧啶50g/ mL，萘啶酸50μg／mL ，依諾沙星20μg／mL ，氨苄青黴素鈉鹽2g／m L，硫酸鏈黴素1g／m L，放線酮50μg／m L，製黴菌素5 0μg／mL ，pH 9.0) ，32℃培養，14～21d 。 

2.3選擇性分離  Planomonospora  Planomonospora在一些分離培養基，如澱粉—硝酸鹽酪素瓊脂、 放線菌分離瓊脂和蛋清瓊脂，不能形成特征性孢囊。而在HSG上能夠產生豐富的孢囊。雖然在 HVA上， Planomonospora 也形成孢囊，但與HSG相比，稀疏得多。分離培養基的堿性環境利於Planomonospora孢囊的形成。CHES ( pH 9.0 ) 和 0.1 ％脫脂牛奶對動孢菌的分離效果得到進一步的驗證。

分離程序如下：風幹土樣在100℃幹熱處理， 1 h ，用CHES ( 5 mM  pH 9.0 ) 和0.1％脫脂牛奶製成土壤懸液，32℃ 振蕩90 mi n ， 離心1000 g，10 m i n， 32℃再培養，1 h ， 塗布 HSG平板(三甲氧苄二氨嘧啶20μg／mL，萘啶酸20μg／m L， 依諾沙星20μg／m L，氨苄青黴素鈉鹽2g／mL，放線酮50μg／m L，製黴菌素50μg／mE )，35℃培養，14-21d 。 

2.4選擇性分離   Actinomadura   rugatobispora  Actinomadura   rugatobispora形成綠色的氣生菌絲，並在氣生菌絲上產生豐富的縱向排列的成對孢子，孢子表麵多皺，有脊。  A．rugatobispora容易從形態特征進行鑒別。在一些分離培養基上，如澱粉—硝酸鹽酪素瓊 脂、 放線菌分離瓊脂和蛋清瓊脂，A．rugatobispora不產生孢子。在HVA上，部分菌株當平板上菌落數隻有5～20個時，產生稀疏的孢子。而在 HMG上，都能產生豐富的孢子。 

HMG即HVG中另外加入1g／L嗎啉丙磺酸( MOPS ) ，維持培養基pH8.0，利於A．rugatobispora的生長。分離培養基中加入硫酸慶大黴素和氨苄青黴素鈉鹽，用於抑製鏈黴菌等非目的菌的生長。

分離程序如下：風幹土樣在120℃幹熱處理，l h ，用無菌生理鹽水梯度稀釋製成土壤懸液，塗布平板( HMG，硫酸慶大黴素100 g／mL， 氨苄青黴素鈉鹽20g／mL ，三甲氧苄二氨嘧啶50μg／mL， 萘啶酸10μg／m L，放線酮50μg／mL ， 製黴菌素 50μg／mL ) ， 35℃培養，2l～ 28 d 。

3 結束語