《水生微生物實驗法》——水中誌賀氏菌的檢驗和分離

誌賀氏菌是一種引起痢疾病的痢疾杆菌，由日本細胞學家誌賀首先發現的，故將這一屬的細菌稱為誌賀氏菌屬。根據生化反應、抗原的不同可分成四類：

① 誌賀氏痢疾杆菌和斯米茨氏痢疾杆菌

② 弗氏痢疾杆菌

③ 博伊德民（Boyd ）痢疾杆菌。

④ 宋耐（Sonnei ）痢疾杆菌。

1 ．培養基成分及製備

（1） G . N ．增菌液：

胰蛋白腖20 克

葡萄糖1 克

甘露醇2 克

枸櫞酸鈉5 克

去氧膽酸鈉0.5 克

K₂HPO₄  4 克

KH₂PO₄   1.5 克

NaCl  5 克

蒸餾水1000 毫升

pH 7.0

將上述各物溶於水中，加熱使溶解，校正pH 過濾，分裝於試管，每管5 毫升。在115℃ 下蒸汽滅菌20 分鍾．保存於冰箱待用。

（2）沙門氏，誌賀氏菌屬瓊脂基（簡稱S .S ．瓊脂）:

膘蛋白腖5 克

乳糖10 克

膽鹽8.5-10 克

枸櫞酸鈉8.5-13克

Na₂S₂O₃·5H₂O   8.5-10克

枸櫞酸鐵0.5克

牛肉膏5 克

瓊脂17-20克

0.5%中性紅水溶液4.5毫升

0.1%煌綠溶液0.33毫升

蒸餾水1000毫升

將除中性紅和煌綠溶液外的其他成分煮沸溶解，調pH 為7.1 ，加入中性紅和煌綠充分搖勻，再煮沸l-2 次，用牛皮紙包好瓶門。冷至55℃ 左右，傾注於滅菌平皿成平板培養基．存於暗處備用。注意事項如下：

① 此培養基切忌高壓滅菌，或加熱的時間過長。

② 配成平板培養基後．在接種前應先使培養基表麵幹燥，便於分離接種．一般的方法是倒放於培養箱l 小時左右，當日使用．

③ 此培養基質量的優劣主要是與膽鹽有關。要獲得比較滿意的結果．每批膽鹽購到後，選擇若幹菌株，於實驗室內用S.S瓊脂作對照試驗。必要時可適當調節鹽類和膽鹽的用量。要求達到：

a ．沙門氏菌屬和誌賀氏菌屬均能生長，並保持在S.S瓊脂上應有的特征。

b ．對大腸杆菌有一定的抑製能力．生長的大腸杆菌呈桃紅色。

c．無膽酸擴散沉澱現象。

④ 煌綠溶液配製後，應在10 天內使用，過久不宜使用。

( 3 ）雙糖鐵瓊脂．

上層成分：血消化湯500 毫升

瓊脂6.5克

Na₂S₂O₃·5H₂O   0.1克

FeSO₄(NH₄)₂SO₄·6H₂O   0.1克

乳糖5克

0.4%酚紅溶液2.5 毫升

下層成分：血消化湯500 毫升

瓊脂2 克

葡萄糖1 克

0.4%酚紅溶液2.5毫升

製法如下：

上層：

① 將血消化湯和瓊脂混合，加熱溶解，調pH 為7.8-8.0，用3-4 層的紗布過濾。

② 加入其他成分搖勻，使其溶解，裝入燒瓶中。

③ 在115℃蒸汽下滅菌10 分鍾．取出，立即放於56℃ 的水浴內，待用。

下層：

① 與② 同上層的① 與② 步驟，但分裝試管中，每管2 毫升。

③ 在115℃蒸汽滅菌15分鍾後，讓其直立凝固。

凝固後．按無菌操作將上層培養基乘熱裝於下層培養基上麵，每管約裝1.5毫升．製成斜麵，待用.

2 ．濾膜濃集

一般情況下，水中的誌賀氏菌的數量不多，不容易檢驗分離出來，必須先通過濃集、增菌培養階段，而後再進行分離鑒別．

濾膜濃集法．適於澄清的水樣．取一定量的水樣。按分離基本技術中的超濾膜法進行。

3 ．增菌培養

將濾膜的全部或部分放入G . N ．增菌培養基，在37℃下培養，培養時間不得超過24 小時。因培養的時間長了，會使綠膿杆菌、變形杆菌等非致病性細菌過度增長。

4 ．平板鑒別培養

用少量的增菌液在S.S平板培養基上塗布均勻，於37℃下培養24 小時。沙門氏菌與誌賀氏菌因不發酵乳糖而菌落不著色，呈半透明，如有大腸杆菌群細菌生長，則菌落呈紅色。某些變形杆菌與沙門氏菌的菌落中心也可呈黑色。

5 ．雙糖鐵斜麵培養

挑選上述可疑菌落接種於雙糖鐵培養基，在37℃ 下培養18-24 小時，由於大腸杆菌群在此種培養基上僅僅受抑製而不長，並沒有被殺死。故挑取菌落時應僅挑其中心部分，否則四周的雜菌也可能一並被挑入，影響下一步鑒定工作的順利進行，也影響鑒定效果的正確性。

誌賀氏菌的菌落和沙門氏菌相似，無色、半透明、邊緣整齊，但較小和較為透明些，且更扁平。宋氏誌賀氏菌的菌落較大，邊緣較不整齊，且因遲緩發酵乳糖，在S.S．瓊脂平板上的菌落有時呈玫瑰紅色．所以供生化鑒定的菌落應多挑幾個以防遺漏．

6 ．一般的生化鑒定

經雙糖鐵斜麵培養，如果在底層葡萄糖產酸不產氣，無動力，不產生硫化氫，上層斜麵乳糖不分解，則可視為可疑的誌賀氏菌，可進行生化和血清學檢驗。

生化檢驗項目包括：葡萄糖、甘露醇，麥芽糖、乳糖、蔗糖、靛基質、硫化氫、動力、尿素。誌賀氏菌屬能分解葡萄糖、但不產氣（弗氏誌賀氏菌b 型有時能產生少量氣體）; 一般不分解乳糖及蔗糖（宋氏誌賀氏菌對乳糖及蔗糖遲緩發酵產酸）；誌賀氏菌均不產生硫化氫．不分解尿素，無動力，對甘露醇、麥芽糖的發酵及吲哚的產生，則因菌株不同而異。在37℃培養後無動力者，必要時，放室溫觀察4-5 天．

如遇多價血清玻片凝集試驗為陰性，而生化反應符合上述情況時，可加做肌酵、水楊苷、V . P ．、枸櫞酸鹽、氰化鉀等試驗，誌賀氏菌屬均為陰性反應。吲哚產生陽性的無動力菌株．可加做5 %乳糖發酵管和葡萄糖銨試驗，誌賀菌屬均為陰性。

7 ．係統生化檢驗

表2-7 誌賀氏菌屬的係統生化檢驗

注．十90 %以上陽性；-90%以上陰性；( + ）遲緩陽性；d 有不同生化型．十/-多數陽性：-/+多數陰性．少數遲緩陽性．

誌賀氏菌屬的生化反應和抗原特性，有時產生變異．故必要時，按係統的生化特性作鑒定，凡符合表2-7 的菌株可鑒定為誌賀氏菌屬。如果在水樣中檢驗到誌賀氏菌，則該水質已受汙染．視單位水樣中的誌賀氏菌數量，可確定受病原菌汙染的程度。

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