《水生微生物實驗法》——分離與純化（3）

（五）單細胞分離法

為了純化、確保一個菌株是由一個細胞發育而來的，需要進行單細胞分離，作為稀釋平板分離的懸液，如果是經過充分分散，並稀釋到合適稀釋度下，再經過脫脂棉過濾．那麽在平板上長出的菌落，基本上是由單細胞形成的。較為可靠的單細胞分離法是：毛細管分離法、小滴分離法和顯微操作器法。

1 ．毛細管分離的兩種方法

能產生體積較大，顏色較深的一些黴菌的分離，可采用毛細管分離法。此法較簡便，其分離步驟如下：

（1）將玻璃管燒熔抽成毛細管，長度為5 厘米和20厘米兩種，置於160 ℃ 下幹熱滅菌．

（2）將欲分離純化的樣品，用熔化後涼至45℃ 瓊脂培養基管製成懸液，保持於45℃ 水浴中。

（3）將載玻片在酒精火焰上滅菌，涼後置於顯微境載物台上。

（4）取毛細管吸懸液放於載玻片上．用低倍鏡檢查，當找到單個分生孢子，而且距離左右兩側的分生孢子較遠時，用無菌鑷子將此段毛細管折斷。

（5）用酒精消毒含有單個分生孢子毛細管， 然後將其檢出放入斜麵培養基上培養。

（6）分生孢子萌發並形成菌落後，檢查其純度。

第二種方法的步驟如下：

（1）將拉成的毛細管的一端彎成直角．經酒精消毒後．粘於顯微鏡的聚光透鏡上，使彎日轉上。將集光器旋下，使毛細管尖端位於通光孔的正下方。

（2）將欲分離的孢子用無菌水製成適宜稀釋度的懸浮液，滴1 滴於滅菌的載玻片上，反轉放在載物台中央，使水滴位於通光孔中央，成懸滴．

（3）用低倍鏡尋找懸滴中的單個孢子．旋上集光器，逐漸在視野中見到毛細管口．移動玻片使毛細管口對準單個孢子，再旋上集光器使管口接觸孢子。由於毛細管作用，孢子被吸入毛細管內．

（4）取下毛細管，將管內水滴移於新鮮平板培養基上培養，待長成菌落後檢查其純度。

2 ．小滴分離法

（1）將無菌吸管頂端經火焰燒熔拉成毛細管，

（2）將要分離的樣品製成適宜稀釋度的懸浮液。

（3）以毛細管吸懸液於無菌蓋玻片上．縱橫排成行，每數小滴。

（4）倒置蓋玻片於凹形載玻片上，或倒置於有玻璃圈或火柴杆作支架的載玻片上．

（4）鏡檢發現某小滴中隻含單細胞或單個孢子時，用另一無菌毛細吸管將此液滴內的單細胞移到新鮮平板培養基上培養。

3．顯微操縱器的分離法

顯微操縱器是一種與顯微鏡相聯合的裝置。此種儀器上所裝的微針，在顯微鏡的視野可以對細胞或組織進行解剖、移動或作其他處理，故能從視野內運用此器械挑取單細胞或單個孢子，並轉移到無菌培養基內。采用此法的優點是能確證所得的培養物是由單細胞發育而成的。缺點是要具備昂貴的設備和熱練的技術，操作時較慢．染雜菌的機會多．

操作步驟，

① 濕室與分離麵的準備分離操作前應在小室內四角各放一團濕棉花，以保證小室內的適宜濕度。在潔淨的蓋片上均勻地塗一層滅菌的油脂（50%凡士林和50%石蠟混合物）蓋於小室的小孔上，使油脂麵向下作為分離麵．待小室內濕度達到飽和時（約經10 分鍾）開始操作。

② 毛細管與操縱器的準備；

a ．將顯微鏡的聚光器聚焦於蓋玻片上，把操縱器向兩側拉開。

b ．應用毛細管作用吸進菌液到毛細管內．而後將其固定在右側操縱器上。

c ．慢慢推動操縱器，將其頭部（微針）送進小室側孔，使吸管切口向上．

d ．在吸管尾端約5 厘米處用夾子夾住．

e ．在左側操縱器上固定吸有液體培養基的長約5 厘米的毛細管，同樣將其頭部伸進小室的另一側孔，也使切口向上．兩根管不能互相接觸．以免汙染左側管。

③ 菌液稀釋度的鏡檢，轉動右側操縱器螺旋，使毛細管口與分離麵接觸，輕輕擠壓橡皮管，使菌掖在分離麵形成一微滴，大小不能超過高倍鏡視野．迅速轉動調節器使操縱器降低，而毛細管離開分離麵，以免菌液重新回到管內。觀察液滴，若其中僅有0-2 個需分離的菌細胞，則此菌液的稀釋度適用。

④ 菌液吸取及接種，如菌液滴的菌數合適時（最好為1 個細胞），在低倍鏡下把左側的毛細吸管移到掖滴下。在高倍鏡下證實管口對準菌液後，抬高左操縱器．使管口與液滴接觸，並將其吸入管內，然後使管口脫離分離麵，用高倍鏡證實液滴中菌細胞確實吸入管內後，取出毛細吸管，將其中菌細胞擠出接種於培養基中，則可培養出單細胞長成的菌落。

操作注意事項；

① 毛細吸管口必須圓整光滑。

② 濕室濕度要適當．可用兩側孔開閉程度調節。

③ 蓋玻片油脂要均勻。

④ 菌液稀釋度必須適宜，使分離麵上液滴內，多數隻含1個細胞。

（六）超建膜分離法

在遠洋海水、礦泉水、瓶裝啤酒等當中，細菌的濃度常常很稀薄（10²-10³ 個細胞／升．或更少）．為了進行有效的分離或定量地計數菌數，必須將一定量樣品通過超膜過濾。使細菌濃縮粘附於膜上，而後進行培養分離或計數。

1 .超濾膜濾器

由玻璃製成，分上下兩部分：上部為其有刻度的圓筒，筒上有蓋；下部為碗狀漏牛：碗口中央嵌著一塊3 號砂芯濾板。濾膜被夾在濾器上下兩部分之間．濾器上下部的兩側各有彼此對稱的掛鉤。由於掛鉤上的彈簧或橡皮圈的拉力，使上下兩部緊閉不漏水．根據用途不同超濾膜濾器需備有大小兩種，大的口徑30 毫米，小的口徑10毫米。

2 ．超濾膜

以硝化纖維為主要原料製成的白色薄膜，其規格如下：孔徑平均為0.3 微米的一號濾膜，其中最大孔徑不能超過0.5 微米．厚度為0.1 ±0.02毫米。直徑為15 和35 毫米的兩種。韌性．達到對折不斷的要求。

3 ．分離步驟

（1）超濾膜在使用前應先經滅菌處理．取自徑為35 毫米的超濾膜數張，放入裝有150-200 毫升蒸餾水的300 毫升的燒杯中，加熱煮沸15-20分鍾．直到蒸汽中無丙酮氣味為止。

（2）使用無菌的鑷子取出超濾膜，仔細地裝於超濾膜器上．裝過濾器於抽濾瓶上，並通過三通活塞與真空泵連接，三通另一餘端塞上少量棉花，直通大氣

（3）以無菌移液管吸取10.0-30.0毫升水樣放入濾器．

（4）開動真空抽象泵抽濾．使水樣中的微生物濃縮在濾膜上，操作時須注意過濾速度，太快，可能使濾膜破損，需重作。當抽濾到濾膜上的最後一滴水恰好滴下時，應立即轉動三通活塞，停止抽濾。

（5）打開濾器，用無菌鑷子輕輕取下濾膜使過濾麵向上，放於無菌的小培養皿的濾紙（先經選擇性培養基浸透、烘幹、滅菌，使用前用無菌水濕潤）上，或者放在平麵培養基上。此時應使濾膜和濾紙或培養基之間互相緊貼，無氣泡、蓋好培養皿，寫明日期、編號，並將小培養皿放於鋪有用水浸透了脫脂棉的大培養皿（直徑15 厘米）中。蓋好大培養皿，借以保持皿內的濕度。用不同量的水樣重複上述步驟，以便長出單獨易挑選的菌落．

( 6 ）在18-20 ℃ 下培養4-7 天，待長出明顯菌落時，挑選典型菌落，接種於合適的斜麵培養基上，或直接在適宜的平麵培養基上劃線再分離，直到菌落形態一致，供鑒定用．膜上長出的菌落也可供計算用，取平均值。

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