培養基手冊2005——3

培養基產品分為細胞培養基、平衡鹽、細菌培養基產品。

 

（一）平衡鹽（balanced salt solution，BSS）

1885年Sydney Ringer開發生理鹽水發展而來，由無機鹽、葡萄糖和水組成。平衡鹽通常以其發明者命名，基本平衡鹽溶液都是基於細胞需要鈉、鉀、鈣、鎂和磷酸鹽這5種離子開發而來，隻是在離子濃度和鹽的形式上有所區別。

平衡鹽的主要功能是維持細胞內外滲透壓平衡、控製和維持酸堿平衡在生理範圍之內、提供能量和代謝所需的無機離子。平衡鹽培養基可用於配製培養用液基礎液及細胞洗滌液。常用的平衡鹽有：

1．Dulbecco^,s平衡鹽（D-PBS），不含碳酸氫鈉；

2．Hanks^,平衡鹽（HBSS），含碳酸氫鈉少，約0.35mg/L；

3．Earle^,s平衡鹽（EBSS），含碳酸氫鈉多，約2.2mg/L；

4．PBS平衡鹽，無Ca²⁺、Mg²⁺離子。

 

（二）細胞培養基

1．傳統基礎細胞培養基及其改良培養基

基礎細胞培養基通常指基礎合成培養基，主要成分為氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽、輔助物質（核酸降解物、氧化還原劑等）。

據不同細胞和研究目的，選用合適培養基,還可補加新成分。如雜交瘤中常用DMEM加丙酮酸鈉、2-巰基乙醇（相當於胎牛血清可透析組分的作用）。

合成培養基使用時加5-30%血清。

（1）    199細胞培養基及其改良品種

1950年由Morgan等設計，除BSS外，含有53種成分，添加適量的血清後，可廣泛用於多種細胞培養、病毒學、疫苗生產等。

199（HB）細胞培養基，主要應用於Vero細胞、地鼠腎細胞轉瓶培養生產狂犬、乙腦等疫苗，具有高緩衝性能，能夠有效提高病毒滴度。

l       改良199細胞培養基——199（HB）細胞培養基

狂犬疫苗生產實踐證明，199（HB）細胞培養基與傳統199細胞培養基相比，具有以下優勢。

a)      細胞生長形態好

用199（HB）細胞培養基培養的細胞生長速度相對較快，形態良好。

 

b)      營養液的pH較穩定

用199（HB）細胞培養基配製病毒維持液pH值較穩定，經過3－4天的細胞培養後pH值變化小。

c)      病毒原液滴度高

用199（HB）細胞培養基收獲的病毒原液相對用199培養基收獲的病毒原液平均滴度要高，尤其對二次苗的影響。

注：一次苗、二次苗分別為第一次和第二次收毒。

d)      純化後原液的效力明顯提高

用199（HB）細胞培養基培養後，對純化後原液的效力影響比較明顯，對效力有明顯提高。

 

（2）    BME細胞培養基

基礎Eagle培養基（Basal Medium Eagle），1955年由Eagle設計，BSS＋12種氨基酸＋穀氨酰胺＋8種維生素。簡單、便於添加，適於各種傳代細胞係和特殊研究用，在此基礎上改良的細胞培養基品種有MEM、DMEM、IMDM等。

（3）    MEM細胞培養基

低限量Eagle培養基（Minimal Essential Medium），1959年修改配方，刪去賴氨酸、生物素，增加氨基酸濃度，適合多種細胞單層生長，是一種最基本、適用範圍最廣的培養基，是一種被廣泛應用的培養基。

需要注意的是，MEM細胞培養基有含Earle's平衡鹽的類型，也有含Hanks'平衡鹽的類型；有高壓滅菌型的，也有過濾除菌型的；還有含非必需氨基酸的類型。生產和科研時，應根據實際情況注意選擇合適的MEM細胞培養基。

另外，因MEM培養基營養成分所限，針對生產之特定細胞培養與表達時，並不一定是使用效果最佳或者最經濟的培養基。

（4）    DMEM細胞培養基及其改良品種

DMEM由Dulbecco改良的Eagle培養基，各成份量加倍，分低糖（1000mg/L）、高糖（4500mg/L）。細胞生長快。附著稍差的腫瘤細胞、克隆培養用高糖效果較好，常用於雜交瘤的骨髓瘤細胞和DNA轉染的轉化細胞培養。例如CHO細胞表達生產乙肝疫苗、CHO細胞表達EPO。

l       改良DMEM細胞培養基——DMEM（HED）細胞培養基

DMEM（HED）細胞培養基，培養CHO細胞生產乙肝疫苗，具有較強細胞維持能力，可增加收液次數，有效提高蛋白表達率。

生產和試驗研究證明，DMEM（HED）細胞培養基在細胞生長和病毒分泌方麵均優於使用DMEM細胞培養基。[1]

a)      使用DMEM（HED）細胞培養基細胞貼壁和長滿單層時間明顯快於傳統DMEM細胞培養基，維持2個月細胞未出現脫落現象。

使用DMEM（HED）細胞培養基，在接種後第2天， 80％細胞已伸展並開始分裂增殖，第3天已長成較密單層，細胞貼壁均勻，形態清晰，呈多邊形和梭形，細胞間略有空隙，細胞數為7.5 x 10⁶個／ml。在此後轉瓶培養的60 d內細胞數保持穩定，無明顯增加和減少，無脫落，無明顯形態變化，培養液中HBsAg滴度穩定在1：128～1：512之間。

而使用傳統DMEM細胞培養基，隻有30％和40％的細胞伸展，至第4天才長成較密單層，小方瓶與雙層轉瓶結果相同。至30 d 時已長成較厚的複層，並開始大片脫落，細胞數明顯減少，HBsAg滴度降低，最低降到1：32 。此後細胞開始重新貼壁、增殖，至45 d左右部分細胞長成單層，一部分細胞因脫落，至60 d時仍未能長滿轉瓶。

b)      分泌HBsAg量明顯高於傳統DMEM細胞培養基組。

 

（5）    IMDM細胞培養基

IMDM是由Iscove's改良的Eagle培養基，增加了幾種氨基酸和胱氨酸量。可用於雜交瘤細胞培養，以及無血清培養的基礎培養基。

（6）    RPMI-1640細胞培養基

Moore等人於1967年在Roswell Park Memorial Institute研製，針對淋巴細胞培養設計，BSS＋21種氨基酸＋維生素11種等，廣泛適於許多種正常細胞和腫瘤細胞，也用做懸浮細胞培養。

（7）    Fischer’s細胞培養基

用於白血病微粒細胞培養。

（8）    HamF10、F12細胞培養基

1963年、1969年由Ham設計，含微量元素，可在血清含量低時用，適用於克隆化培養。F10適用於倉鼠、人二倍體細胞，F12適用於CHO細胞。

（9）    DMEM/F12細胞培養基

DMEM和F12細胞培養基按照1:1比例混合效果最佳，營養成分豐富，且可以使用較少血清，或作為無血清培養基的基礎培養基。

2．低血清細胞培養基

血清對於在傳統培養基配方中生長和增殖的大多數細胞係來說是必不可少的。大部分的組織培養研究者非常熟悉血清添加物給予基本培養基配方的良好生長支持特征。然而，伴隨血清的使用也帶來了很多的問題。

l        費用因素

生產血清費用高而效率低。小牛血清還必須來源於沒有瘋牛病、口蹄疫和其它高度傳染性疾病的地區。

l        差異

所有的血清都是一種成分不確定的混合物，血清批與批之間的組分存在差異。

l        傳染源

動物血清有可能攜帶傳染源，包括支原體、病毒和有毒物質。任何一種傳染源可能對正在生長的細胞係或者製品帶來風險。

l        法規問題

為了使與傳染源相關的風險減少到最低，存在多個國家間進出口生物材料的國際法規。

為了解決這些問題，清大天一公司開發了多種營養培養基，以最小化和消除與使用動物血清相關的製品安全性問題。

（1）    低血清細胞培養基的原理

通常在用傳統培養基培養細胞時須加入約10％的小牛血清，低血清培養基是在基礎培養基中添加了額外的營養成分，使小牛血清的添加量減少50％到70％，而對於細胞生長、增殖、形態和功能有較小或者沒有影響。

（2）    低血清培養基的優點

l        小牛血清是細胞培養液成本最大的原料，使用低血清培養基明顯地節省培養液成本。

l        減少製品純化損失，提高純化收率，便於分離純化。

l        減少由於不確定蛋白或者其它血清組分帶來幹擾和差異的風險。

l        提高製品安全性。

l        批間差減少或影響降低：

a)      血清用量減少可以減少使用批次。

b)      血清用量減少使得批間差的影響減少。

l        細胞在低血清培養基的生長相當或者優於加入10％小牛血清的傳統培養基，沒有觀察到在細胞形態及增殖方麵的顯著差異。

（3）    低血清細胞培養基的應用

    VERO細胞、BHK21細胞等細胞在轉瓶、微載體反應器中的培養。

1．無血清無動物組分細胞培養基

無血清無動物組分細胞培養基意指以該培養基配製的培養液無須添加牛血清即可培養細胞和維持生長收液，且該培養基成分中不含有任何動物來源成分。

在細胞培養生產生物製品過程中無須添加動物來源成分，避免瘋牛病、口蹄疫等傳播進入人體，減少人、獸在使用生物製品時的特異性免疫反應、降低產品成本（如降低培養液成本，簡化下遊純化工作及提高產品收獲量等）。采用生物反應器、無血清無動物來源成分培養基進行細胞培養製藥是21世紀生物製藥發展趨勢；美國FDA和美國農業部已經嚴格控製在細胞培養中胎牛血清的使用。

同時，高密度細胞培養並長時間維持細胞密度是高表達率和高產量的關鍵，隻能通過無血清懸浮培養技術來實現。

為了獲得足夠的營養成分，無血清無動物組分細胞培養基中氨基酸含量倍增，另外添加了生長因子和/或細胞因子，以及含有個別蛋白或大量蛋白的組分。

無血清無動物組分細胞培養基通常是特定細胞專用培養基，如無血清無動物組分CHO懸浮細胞培養基適用於CHO懸浮細胞。

2．替代天然培養基

培養基中不包含有蛋白、水解產物或未知結構的組分，所有的成分均有已知的化學結構。

（三）細菌培養基

細菌培養基為肺炎、流腦等細菌培養疫苗生產專用培養基。用於細菌性疫苗大規模生產中細菌體的培養及實驗室中細菌體的研究培養。

目前細菌性疫苗生產廠家及實驗室都使用自行配製的培養基進行細菌體的繁殖培養，由於配製工藝的不同、各種培養基組分來源不同，以及培養基中重要活性添加劑來源的質量不穩定性，導致了細菌體繁殖培養的數量和質量不穩定，批間差較大，結果時好時壞，該結果不僅給培養基使用者增加了成本，還嚴重影響了疫苗生產廠家的產量和質量，延誤科研進程。