國產MH瓊脂質量控製的探討

MH瓊脂( M u l l e r   H i n t o n   A g a r ) 是至今被國際公認和 WHO推薦的最適用於瓊脂紙片擴散法 ( K i r b y--B a n e r 紙片擴散法) 測定細菌對抗生素敏感性的培養基。究其原因，主要由於MH瓊脂培養基產品批間藥物敏感試驗重複性比其他培養基好；接種於 MH瓊脂培養基上， 絕大多數致病菌生長良好；MH瓊脂培養基對磺胺、甲氧苄胺嘧啶、四環素的抑製成分含量低。國內外有關藥物敏感試驗的大量數據是由 M H瓊脂作為培養基試驗得出的。 

1   國產MH瓊脂培養基作為藥敏試驗培養基使用存在的主要問題

1.1 批間產品的穩定性

國產MH瓊脂培養基批間產品穩定性不夠，主要是MH瓊脂中主要原料的質量不穩定性造成的：①酸水解酪蛋白( C a s e i n  Hydrolysate ) ，水解工藝的不穩定性。②牛肉浸出粉( Beef ， Dehydrated  infusion From) ，混有經酶消化的牛肉膏粉。③瓊脂，去除遊離的礦物質，才能保證藥敏試驗的結果。瓊脂的凝膠強度及在培養基中的濃度均能影響藥物的擴散 。④培養基堿性增加能擴大氨基糖苷類藥物的抑菌圈。酸性增加能擴大四環素的抑菌圈。MH瓊脂一般pH為7.2～ 7.4，接近人體體液的p H值。

1 .2 拮抗物質

MH瓊脂原料中存在過量的被測藥物的拮抗物質：① 胸腺嘧啶核苷( Thymidine )胸腺嘧啶( Thymine ) 抑製磺胺類藥和甲氧苄胺嘧啶的活力。胸腺嘧啶核苷對TMP的抑製是胸腺嘧啶的10倍。② MH瓊脂中胸腺嘧啶和胸腺嘧啶核苷水平是否足夠低， 是否在合格範圍內， 美國國立臨床實驗室標準委員會( NCCLS ) 規定可用 TMP—SMZ紙片鑒定，它對糞腸球菌 ATCC 29212的抑菌圈直徑應 ≥2 0 m m， 且邊緣清晰，這是檢測 MH瓊脂是否合格的標準之一( 表 1 ) 。 

 

表1 標準菌株在6種MH瓊脂上對TMP-SMZ的抑菌圈50次測試平均值和測試範圍（mm） 平均值用X表示

 

 

 

 

2 0 0 7年上海市疾控中心培養基室用 3株標準菌株在不同批次自配 M H瓊脂上對 T M P—S MZ進行了抑菌圈測試，結果見表2 。自配 MH瓊脂對糞腸球菌 ATCC29212的平均抑菌圈為20.5 m m，表明原料中胸腺嘧啶和胸腺嘧啶核苷的含量是基本合格的。3株標準菌株抑菌圈的變異係數( CV) 均小於5 ％， 表明國產自配MH瓊脂的穩定性還是可以的。 

表2   標準菌株在不同批次自配MH瓊脂上對TMP-SMZ的抑菌圈測試結果（mm）

 

 

1.3二價離子

Mg²⁺  、Ca²⁺在培養基中的濃度變化，影響四環素、多粘菌素、氨基糖苷類藥物的抗菌活性。含量過高，使抑菌圈變小；含量過低，使抑菌圈變大。特別對銅綠假單胞菌的敏感性影響較大。一般認為，1000  mL培養基中Ca²⁺  50～200 mg ， Mg²⁺  20～35 mg較為適宜。Cu²⁺、 Zn²⁺ 、 Sn²⁺在培養基中隻要微量存在，青黴素就會很快分解成青黴素噻唑酸而失去抗菌活性。SO₄^2- ，瓊脂中極易殘存此子， 其可與多粘菌素、新黴素等藥物發生化學反應， 從而影響藥物的擴散和抗菌活性  。 

1.4其他

氨基甲酸乙脂( Urethane )、葉酸、葡萄糖、某些蛋白腖和氨基酸對磺胺類藥均有不等的拮抗作用。 

2 幹擾 MH瓊脂質量的外界因素

2.1藥敏紙片 

標準紙片直徑為1／4時 ( 約6.35mm) ，重量為 ( 30± 4 ) mg／cm² ，吸水性為重量的2.5～ 3.0倍， pH= 7.0 ，無影響抗菌活性的二價離子。抗生素含量必須符合 NCCLS規定的濃度。長期保存應置於 -2 0 ℃以下低溫冰箱。使用前應將使用量紙片置 0 ~ C預溫  。 

2.2 細菌接種量

細菌接種量是控製試驗重複性的主要因素。一般接種量是0.5麥氏單位的菌液約0.1mL 。加大菌量可使抑菌圈縮小， 反之能使抑菌圈擴大 。 

2.3 平皿製備與保存

9.0 c m平皿傾注培養基一般為 25～ 30 mL ， 15cm平皿為60 mL， 厚度均應達4mm。如大量配製應對產品抽樣，於3 0～ 35℃， 24 h作無菌試驗培養。平皿應置於密封塑料袋內放入冰箱， 2～7℃保存。有效期為7 d。 

2 .4 培養溫度和時間

最佳培養溫度為 35℃， 培養時間為16～18 h 。溫度偏低細菌所需生長時間延長，造成抑菌圈變大； 溫度超過 35℃， 可使某些抗生素如：苯唑青黴素、甲氧苯青黴素等失效。有學者發現，在35℃培養時，對甲氧苯青黴素耐藥的金黃色葡萄球菌在 3 7 ℃時可不顯示耐藥  。 

3 推薦的 MH瓊脂質控方法

3.1培養基製備

按幹粉培養基說明，正確稱量和加蒸餾水或去離子水。煮沸溶解後，置 121℃ 15 mi n滅菌。冷至5 5℃左右， 傾注無菌平皿。9c m平皿約2 5～ 3 0 m L ，達到厚度4 m m。MH瓊脂最終 pH在 2 5 ℃應為7.2～ 7.4   。 

3.2 常用質控菌株

糞腸球菌 AT C C   2 9 2 1 2； 大腸埃希菌 A T C C   2 5 9 2 2；

金黃色葡萄球菌 A T C C   2 5 9 2 3 ； 銅綠假單胞菌 A T C C   2 7 8 5 3 。 

3.3 質控菌株的保存

短期保存 ，可用胰蛋白腖大豆瓊脂斜麵 ，4～8 ℃保存， 每周傳代 1 次。長期保存， 可將菌株置於合適的穩定性強的保菌培養基中( 如含50 ％胎牛血清或脫纖維羊血的胰蛋白腖大豆肉湯， 亦可用含 1 0 ％ ～1 5 ％甘油的胰蛋白腖大豆肉湯) ， 保存於 -2 0 ℃或更低溫度條件下 。另外，還可用真空凍幹方法保存。每月至少用冷凍或凍幹菌株更換一次質控菌株。 

3.4 工作懸液製備

從 T S A平皿上挑取3～5個形態相似的菌落頂端部分接種 MHB或 T S B培養基。經 3 5℃培養 4～ 6 h 後 ，用無菌生理鹽水稀釋至標準比濁管相同濁度 ( 0.5麥氏單位即約 1.5×1 0⁸  C F U／m L ) 。或用法國生物梅裏埃A T B比濁儀比濁至 0.5麥氏單位。標準比濁管的配方：0.04 mo L／L  BaC1 ₂( 1.175 ％ W／V  BaCl ₂   2 H₂O)0.5 m L，0.7 2 mol /L H₂SO₄ 99.5m L 。0.5麥氏濁度標準管質控，應每月用分光光度計測吸光度，OD值應在0.08～ 0.1 0之間 。 

3.5 試驗步驟

將藥敏紙片、MH平皿從冰箱拿出，預溫至室溫。接種：用無菌棉拭浸取比濁好的菌液， 在管壁內輕輕轉壓除去過多菌液，然後再輕輕塗抹受檢和對照培養基，每一平皿塗抹3次。每次塗抹後均需將平皿轉動6 0度，再行下一次塗抹。目的使細菌呈融合的菌苔生長。每一質控菌 株塗抹3隻平皿 。貼片： 接種後的平皿置室溫片刻， 待稍幹後 ，用無菌鑷子將抗生素紙片均勻貼布於平皿瓊脂表麵。各紙片間中心間距不得 < 2 4mm ， 紙片距平皿邊不得 < 1 5 min 。一旦紙片接觸瓊脂表麵，即不可再移動，因此時藥物已開始擴散。應在15 m i n內完成藥敏紙片的放置。培養 ， 紙片貼妥後，在 15～ 3 0 m i n內，將平皿翻過來 置於3 5℃ 培養 1 6～1 8 h後， 觀察結果。平皿培養時不宜堆放 ， 以2個相疊為宜  。觀察結果，在反射光下，用精確至 1／ 1 0 mm的卡尺測量抑菌圈。MH瓊脂質控參考標準見表 3 。 

表3   MH瓊脂質控參考標準