菌種的衰退、複壯和保藏

 在微生物的基礎研究和應用研究中，選育一株理想菌株是一件艱苦的工作，而要保持菌種的遺傳穩定性更是困難。菌種退化是一種潛在的威脅，因此引起人們的研究與重視。

一、菌種退化現象

    菌種退化（ degeneration ）是指群體中退化細胞在數量上占一定數值後，表現出菌種生產性能下降的現象。常表現為，在形態上的分生孢子減少或顏色改變，甚至變形，如放線菌和黴菌在斜麵上經多次傳代後產生了“光禿”型，從而造成生產上用孢子接種的困難；在生理上常指產量的下降，例如，黑曲黴的糖化能力、抗生素生產菌的抗生素發酵單位下降等。造成菌種退化的原因主要有：

( 一 ) 自然突變

    微生物與其他生物類群相比最大的特點之一就是有較高的代謝繁殖能力，在 DNA 大量快速複製過程中，因出現某些基因的差錯從而導致突變發生，故繁殖代數越多，突變體的出現也越多。一般來說，微生物的突變常常是負突變，是指使菌種原有的優良特性喪失或導致產量下降的突變。隻有經過大量的篩選，才有可能找到正突變。

( 二 ) 環境條件

    環境條件對菌種退化的影響，如營養條件，有人把泡盛曲黴的生產種，在 3 種培養基上連續傳代 10 次，發現不同培養基和傳代次數對澱粉葡萄糖苷酶的產量下降有不同影響，說明營養成分影響菌種退化的速度。環境溫度也是重要的作用因素。例如，溫度高，基因突變率也高，溫度低則突變率也低，因比菌種保藏的重要措施就是低溫。其他環境因子，如紫外線等誘變劑也可加速菌種退化。

（三）衰退的防止

①控製傳代次數；②創造良好的培養條件；③利用不同類型的細胞進行接種；④采用有效的菌種保藏方法。

（四）退化菌種的複壯

    因為在退化的菌種中仍有一些保持原有菌種特性的細胞，故有可能采取一些相應措施，使這些細胞生長、繁殖，以更新退化的菌株，稱之為菌種的複壯。常用方法是①純種分離；②通過宿主體內生長進行；③淘汰已衰退的個體。

二、菌種的保藏

    經誘變篩選、分離純化以及純培養等一係列艱苦勞動得到的優良菌株，能使其穩定地保存、保持原有的特性、不死亡、不汙染，這就是菌種保藏的任務。

( 一 ) 原理

    人為地創造合適的環境條件，使微生物的代謝處於不活潑、生長繁殖受抑製的休眠狀態。這些人工環境主要從低溫、幹燥、缺氧 3 方麵設計。

（二）常用方法

    菌種的保藏方法多樣，采取哪種方式，要根據保藏的時間、微生物種類、具備的條件等而定。下麵著重介紹幾種常用的保藏方法。

1 ．斜麵保藏法

    將菌種接種在試管斜麵培養基上，待菌種生長完全後，置於 4 ℃ 冰箱中保藏，每隔一定時間再轉接至新的斜麵培養基上，生長後繼續保藏。對細菌、放線菌、黴菌和酵母菌均可采用。此方法簡單、存活率高，故應用較普遍。其缺點是菌株仍有一定的代謝強度，傳代多則菌種易變異，故不宜長時間保藏菌種。

2 ．液體石蠟覆蓋保藏法

    為了防止傳代培養菌因幹燥而死亡，也為限製氧的供應以削弱代謝水平，在斜麵或穿刺的培養基中覆蓋滅菌的液體石蠟。主要適用於黴菌、酵母菌、放線菌、好氧性細菌等的保存。黴菌和酵母菌可保存幾年，甚至長達 10 年。本法的優點是方法簡單不需特殊裝置。其缺點是對很多厭氧細菌或能分解烴類的細菌的保藏效果較差。液體石蠟要求選擇優質無毒，一般為化學純規格。可以在 121 ℃ 濕熱滅菌 20min 。要求液體石蠟的油層高於斜麵頂端 1cm ，垂直放在 4 ℃ 冰箱內保藏。

3 ．載體保藏法

    使微生物吸附在適當的載體上 ( 土壤、砂子等 ) 進行幹燥保存的方法。最常用的有砂土保藏法。主要用於能形成孢子或孢子囊的微生物 ( 真菌、放線菌和部分細菌 ) 的保存。此法簡便，保藏時間較長，微生物轉接也較方便，故應用範圍較廣。

4 ．冷凍幹燥保藏法

    這是最佳的微生物菌體保存法之一，保存時間長，可達 10 年以上。低溫冷凍可以用普通 -20 ℃ 或更低的 -50 ℃ 、 -70 ℃ 冰箱，用液氮 (-196 ℃ ) 更好。無論是哪種冷凍，在原則上應盡可能速凍，使其產生的冰晶小而減少細胞的損傷。不同微生物的最適冷凍速度不同。為防止細胞被凍死，

    保存液中應加些保護劑，例如甘油、二甲亞礬等，它們可透入細胞，通過降低強烈的脫水作用而保護細胞；大分子物質如脫脂牛奶、血清白蛋白等，可通過與細胞表麵結合的方式防止細胞膜受凍傷。其缺點是手續麻煩、需要條件高。

    另外還有懸液保藏法、寄主保藏法、液氮保藏法等。