微生物生長的測定

微生物生物情況可以通過測定單位時間裏微生物數量或生物量的變化來評價。通過微生物生長的測定可以客觀地評價培養條件、營養物質等對微生物生長的影響，或評價不同的抗菌物質對微生物產生抑製（或殺死）作用的效果，或客觀反應微生物的生長規律。因此微生物生長的測量在理論上和實踐上有著重要的意義。微生物生長的測量有計數、重量和生理指標等方法。

1 ．計數法

    此法通常用來測定樣品中所含細菌、孢子、酵母菌等單細胞微生物的數量。計數法又分為直接計數法和間接計數兩類。

（ 1 ）直接計數

    這類方法是利用血球計數板，在顯微鏡下計算一定容積裏樣品中微生物的數量。此法的缺點不能區分死菌與活菌。計數板是一塊特製的載玻片，上麵有一個特定的麵積 1mm 2 和高 o .1mm 的計數室，在 1mm 2 的麵積裏又被刻劃成 25 個 ( 或 16 個 ) 中格，每個中格進一步劃分成 16 個 ( 或 25 個 ) 小格，但計數室都是由 400 個小格組成。

    將稀釋的樣品滴在計數板上，蓋上蓋玻片，然後在顯微鏡下計算 4-5 個中格的細菌數，並求出每個小格所含細菌的平均數，再按下麵公式求出每毫升樣品所含的細菌數。

    每毫升原液所含細菌數＝每小格平均細菌數× 400 × l0 000 ×稀釋倍數

(2) 間接計數法

    此法又稱活菌計數法，其原理是每個活細菌在適宜的培養基和良好的生長條件下可以通過生長形成菌落。將待測樣品經一係列 10 倍稀釋，然後選擇三個稀釋度的菌液，分別取 0.2ml 放入無菌平皿，再倒入適量的已熔化並冷至 45 ℃ 左右的培養基，與菌液混勻，冷卻、待凝固後，放入適宜溫度的培養箱或溫室培養，長出菌落後，計數，按下麵公式計算出原菌液的含菌數：

每毫升原菌液活菌數＝同一稀釋度三個以上重複平皿

菌落平均數×稀釋倍數× 5

    此法還可以將稀釋的菌液取 0.2m 1 加到已製備好的平板上，然後用無菌塗棒將菌液塗布整個平板表麵，放入適宜溫度下培養，計算菌落數，再按上公式計算出每毫升原菌液的所含活菌總數。

    此法可因操作不熟練造成汙染，或因培養基溫度過高損傷細胞等原因造成結果不穩定。盡管如此，由於該方法能測出樣品中微量的菌數，仍是教學、科研和生產上常用的一種測定細菌數的有效方法。土壤、水、牛奶、食品和其他材料中所含細菌、酵母、芽抱與抱子等的數量均可用此法測定。但不適於測定樣品中絲狀體微生物，例如放線菌或絲狀真菌或絲狀藍細菌等的營養體等。

    除上述兩種常用的計數方法外，還有膜過濾法、比濁法。膜過濾法是當樣品中菌數很低時，可以將一定體積的湖水、海水或飲用水等樣品通過膜過濾器。然後將濾膜幹燥、染色，並經處理使膜透明，再在顯微鏡下計算膜上 ( 或一定麵積中 ) 的細菌數；比濁法原理是在一定範圍內，菌的懸液中細胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌越多，光密度越大。因此可以借助於分光光度計，在一定波長下，測定菌懸液的光密度，以光密度 (O ． D ． ) 表示菌量。實驗測量時一定要控製在菌濃度與光密度成正比的線性範圍內，否則不準確。微生物計數法，發展迅速，現有多種多樣的快速、簡易、自動化的儀器和裝置等方法。

2 ．重量法

    此法的原理是根據每個細胞有一定的重量而設計的。它可以用於單細胞、多細胞以及絲狀體微生物生長的測定。將一定體積的樣品通過離心或過濾將菌體分離出來，經洗滌，再離心後直接稱重，求出濕重，如果是絲狀體微生物，過濾後用濾紙吸去菌絲之間的自由水，再稱重求出濕重。不論是細菌樣品還是絲狀菌樣品，可以將它們放在已知重量的平皿或燒杯內，於 105 ℃ 烘幹至恒重，取出放入幹燥器內冷卻，再稱量，求出微生物幹重。

    如果要測定固體培養基上生長的放線菌或絲狀真菌，可先加熱至 50 ℃ ，使瓊脂熔化，過濾得菌絲體，再用 50 ℃ 的生理鹽水洗滌菌絲，然後按上述方法求出菌絲體的濕重或幹重。

    除了幹重、濕重反映細胞物質重量外，還可以通過測定細胞中蛋白質或 DNA 的含量反映細胞物質的量。蛋白質是細胞的主要成分，含量也比較穩定，其中氮是蛋白質的重要組成元素。從一定體積的樣品中分離出細胞，洗滌後，按凱氏定氮法測出總氮量。蛋白質含氮量為 16 ％，細菌中蛋白質含量占細菌固形物的 50 ％一 80 ％，一般以 65 ％為代表，有些細菌則隻占 13 ％一 14 ％，這種變化是由菌齡和培養條件不同所產生的。因此總含氮量與蛋白質總量之間的關係可按下列公式計算：

蛋白質總量＝含氮量× 6.25

    核酸 DNA 是微生物的重要遺傳物質，每個細菌的 DNA 含量相當恒定，平均為 8.4 × 10 -5 ng 。因此從一定體積的細菌懸液中所含的細菌中提取 DNA ，求得 DNA 含量，再計算出這一定體積的細菌懸液所含的細菌總數。

3 ．生理指標法