製備培養基的一般操作技術——消毒和滅菌

消毒和滅菌

消毒和滅菌兩個名詞在實際使用中常被混用，其實它們的含義是有所不同的。消毒是指應用消毒劑等方法以殺滅一切病原菌的繁殖體和芽孢而言（亦有認為僅指殺滅繁殖體者），而對非病原性細菌則不一定殺滅之；滅菌是指應用理化學方法殺滅切活菌和芽孢，使物體呈無菌狀態而言。

1.物理方法

（1）幹熱滅菌法

① 火焚：凡無重複使用而又可焚毀的汙染物體，均可用之。

② 火焰滅菌法：如接種環，鑷尖，烙板等可在酒精燈或本生燈火焰中燒灼滅菌；試管口、吸管、培養瓶口等在接種操作時，可通過火焰進行滅菌。

3 幹烤滅菌法：即使用幹熱滅菌箱進行幹烤滅菌。一般加熱至150-160 ℃ ，維持兩小時，即可達到滅菌目的。主要用於空白玻璃器皿的滅菌。進行滅菌時，應有專人經常檢查。以防溫度過於升高（不得超過170 ℃ ），造成意外事故。如僅需烤幹玻璃器皿時，加熱至100℃即可。

( 2 )濕熱滅菌法

① 煮沸：此法適用於注射器、刀、剪、鑷等器械以及橡皮製品和軟木塞等的消毒。一般細菌繁殖體經煮沸5分鍾後即可殺滅。如加入1%碳酸氫鈉，可增強殺菌效果，又可防止金屬物品生鏽。應使用冷蒸餾水以防水鏽，水麵須高出消毒物品至少2-3cm。如物品可疑沾汙有細菌芽孢，可在水內加入石碳酸，使成5%溶液，並煮沸30分鍾。但最好還是使用高壓蒸汽滅菌。

② 流通蒸汽滅菌法：即使用阿諾氏滅菌器或普通蒸籠的流通蒸汽加熱滅菌。其下部水鍋應放入蒸餾水，每次用畢，如不繼續使用，應將水排淨，以防水鏽。一般用於不能耐受高溫的物質，如牛奶，明膠和含糖類的培養基等。其加熱時間，應視消毒物品體積的大小而有所不同，自底鍋水沸騰算起，一般經30分鍾，可殺滅細菌繁殖體。

③ 間歇滅菌法：主要用於含血清雞蛋等的培養基，即將培養基在血清凝固箱內放置成適當料麵，每日加熱75～85 ℃ ，30～60分鍾，連續3 日，取出放入37 ℃ 恒溫箱培養過夜。以檢查滅菌效果。

④ 高壓蒸汽滅菌法：即用高壓蒸汽滅菌器進行滅菌、為培養基製備經常使用的滅菌方法，為了避免操作失誤造成差錯，影響工作，應依據不同型別的滅菌器特性、製訂詳細的操作規程，嚴格遵守進行滅菌。

在高壓蒸汽滅菌器的使用中，最常發生的錯誤是未將蒸汽室中冷空氣排除幹淨，造成已充分滅菌的假象。這是因為空氣傳熱比蒸汽慢，熱空氣在同一溫度下進行滅菌所需的時間可比蒸汽延長3-10 倍。實驗證明，在同一壓力下，因混有不同量空氣。

( 3 )過濾除菌法

即使用各種特殊過濾濾器，將液體中細菌除去的方法。

① 常用的過濾器：有以下幾種：

柏克非爾德（Berkefeled ）濾器：係由矽藻土製成，呈空心棒狀並帶有金屬接頭、帶陰電。分為三型：V 型為粗號型，孔徑在8-12μ之間，N 型為中號型，孔徑在5-7μ之間；W 型為細號型，孔徑在3-4μ之間。可按需要選用。V 型可供澄清和除去較大的細菌之用。N 型可除去一般細菌。W 型可除去所有細菌和較大的病毒。

錢勃蘭濾器：係由無釉瓷和成，為一棒狀整體，無金屬接頭，不易有漏洞。

蔡氏濾器：係以鍍銀的金屬圓形夾持器將石棉濾板夾在中間作為過濾之用，濾板分K 型，普通EK 和特殊E K 三種型別。K 型孔大，供澄清液體用，後兩型可供除菌用，濾板用過後即可棄去，使用方便，故前兩種濾器現巳很少有人使用。

玻璃濾器：帆船牌玻擒濾器按其濾板孔徑大小共分3 種，如表2-8 。

表2-8 玻璃過濾器的規格

新購的玻璃濾器在使用前應先用熱鹽酸或清潔液進行一次抽濾，隨之以蒸餾水抽濾衝洗幹淨，使濾器中存在的灰塵雜質完全清除幹淨。每次用畢都須進行有效的洗滌處理。待別是6號除菌濾板，每次使用後應用有效洗滌液（化學純濃硫酸5.72ml 、硝酸鈉2.0和蒸餾水94ml、 充分混合均勻）進行一次抽濾，當抽至溶液尚未濾盡前，取下濾準浸入洗滌液中約48 小時，濾片兩而均應接觸溶液，取出後用熱蒸餾水抽濾衝洗幹淨並烘幹即可。

火棉膠濾膜：其製法係用火棉膠丙酮溶液以含戊醇不同量的乙醚混合液稀釋製成。即於22.5℃ 恒溫室中，倒入75ml混合液於一直徑為20cm的淺玻璃盤內，自然蒸發1-3小時後，用蒸餾水充分衝洗即得。變更火棉膠用量與組成及蒸發狀況、則可側成平均孔徑自3μ至10nμ 或更小的火棉膠膜。現已有各種規格的商售濾膜和配套的過濾裝置供應，可按需要選購,因使用方便。已普遍采用。

② 過濾操作技術:由於液體僅藉重力作用不易通過濾器，因此，通常須用正壓或負壓進行過濾，但以減壓最為方便。

過濾起始時，減壓應小，然後逐步增大，一般以100-200mm Hg 為限。過濾時間不宜太久，防止螺旋體，弧菌等在屈曲運動時，借減壓通過濾器。若排除弧菌、最好進行兩次過濾。過高減壓，濾液內的微細顆粒可堵塞濾孔以致失去過濾效能。過濾將近完畢時應立即停止抽氣，否則濾液完全濾完時，可將原來不易通過的細菌也隨之濾入。

A 、柏氏濾器的使用方法：裝置前應先將濾器浸入水中並壓入空氣觀察有無明顯漏氣現象。如有較大氣泡逸出時，表明濾器不適使用。特別要注意濾棒和金屬底座銜接處是否緊密。正常情況、濾器內外水應能通暢流通而無較大氣泡發生。

滅菌前將玻筒、濾棒及橡皮塞等裝接妥當，過濾瓶口及側管口加上棉塞，然後分別以厚紙內襯紗布妥為包紮。於高壓蒸汽鍋中121℃滅菌15-20分鍾。

進行過濾時，以無菌操作取出濾器，將橡皮塞裝入過濾瓶口、嚴密塞好，並將其側管連接於抽氣機（l / 8-1／4 PS ）的橡皮管。再將待濾液倒入玻筒內，開始緩慢抽氣保持濾液呈點滴狀流入過濾瓶即可。濾畢，應先將抽氣管夾緊，然後關閉抽氣機，以防機油流入真空係統。待過濾瓶內負壓恢複至常壓後，以無菌操作將過濾液移入滅菌容器。

濾器於使用後，應立即浸泡於2%來蘇溶液中至少半小時，取出，用毛刷在流水中洗刷幹淨。然後用2%氫氧化鈉溶液通過濾器以除去蛋白質等有機物質，再用1MHCl通過濾器使其堿性中和，最後用蒸餾水進行過濾，迄至濾出水呈pH7.4為止。再使其幹燥、以備下次使用。

B 、其他濾器裝置比較簡單，可按照產品說明書即可妥為安裝。其使用原則大致與上述相似。蔡氏濾器用畢後、將濾器全部放水鍋中煮沸半小時，棄去濾板，再在流水中洗淨擦幹即可。玻璃濾器用完後，應先用水由頸端反方向過濾衝洗，再浸泡於10%硝酸溶液或含有1%亞硝酸鈉的1 M 硫酸溶液中過液，使有機物質完全氧化。直至玻璃砂濾板上無黑色存在。再用流水衝洗及蒸餾水過濾、待幹後存放備用。

C 、過濾的濾液應立即吸取少許分別接種血瓊脂料麵和皰肉培養基各一管，置37 ℃ 恒溫箱培養48小時，如無菌生長，方可應用。

③ 影響過濾的因素：一般認為過濾隻不過是機械的過篩作用。即由於濾孔小，因而細菌不能通過，這種理解是不夠全麵的，現已知有些理化因素也能影響過濾作用，例如，在酸性時常能阻滯細菌和某些病毒通過，而在堿性時則較易通過；加溫至25℃的懸液比冷懸液較易通過；稀薄液比粘碉液容易通過等。此外，抽氣壓力的高低也對過濾的效果具有明顯影響。這些都應在進行過濾時加以考慮和注意。

2.化學方法

（1）石碳酸：為一種常用的防腐劑和殺菌劑，易溶於水和有機溶劑。有揮發性。其主要作用是使細菌蛋白質凝固。滲透性較強。1% 溶液能在數分鍾內殺滅大多數病原菌。5%溶液能在24h殺死結核杆菌，殺滅細菌芽孢則需要更長時間。對金屬無腐蝕作用，且不受有機物質的影響。一般消毒浸泡時間至少12 -24h 。加溫可增進其殺菌效能，對機體細胞具有毒性，能通過皮膚迅速吸收。

5%溶液可燒灼皮膚，引起燒傷。配製溶液濃度不宜超過5%，如加入過多。則可有部分石碳酸不再溶解。石碳酸應保存於密封暗色玻璃瓶內以避免揮發。

（2）來蘇兒：為甲酚與綠肥皂製成的棕色液體，一般含甲酚不應少於47%。其殺菌能力因含有皂液，具有脫脂和洗滌作用。有利於酚和細菌接觸，故較石碳酸可強2-4 倍。但其殺菌作用則與石碳酸相似。一般常用量為l-3%溶液。

（3）氯化汞：又稱升汞，為白色結晶粉末，毒性甚強，切勿入口且能腐蝕金屬，能使蛋白質迅速凝固，故不宜用於含有蛋白質的物品，其0.2%溶液對細菌芽孢經1小時可以殺滅。0.1％溶液經數十分鍾浸泡可殺死一般細菌繁殖體，亦可用於手的消毒，為便於識別，避免意外，常加有少許色索。

（4）碘酒：為碘、碘化鉀和酒精的混合溶液，能氧化菌體蛋白質的活動基因，並與蛋白質的氨基結合而使之變性。其碘的濃度通常為2-7%，實驗證明，其1: 2500稀溶液，於10分鍾可殺死炭疽杆菌的繁殖體和芽孢。主要用於皮膚消毒，塗抹後待其幹燥，再以70%酒精擦去，以免刺激皮膚。

（5）乙醇：俗稱酒精，有脫水作用，可使菌體蛋白質凝周變性。50%濃度能在15分鍾殺死細菌繁殖體，但對芽孢無效。故一般酒精可帶有細菌芽孢，在使用時應予注意。通常使用其70%溶液作為皮膚及小型器械等的消毒。

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