菌種與種子擴大培養——微生物工業用菌種（2）

三、菌種保藏

    微生物工業生產與純種培養、菌種質量密切相關，而菌種質量又與菌種的製備和保藏直接相關，所以說，菌種保藏是微生物工業生產的重要環節。菌種保藏的目的是保證菌種在長時間內盡可能保持原有菌株優良的生產性能，提高菌種的存活率，減少菌種的變異，以及不被雜菌汙染以利於生產上長期使用。

    菌種保藏的基本原理是根據菌種的生理、生化特點，創造條件使菌種的代謝活動處於不活潑狀態。在長期保藏菌種的實踐中人們采用了多種方法，以適應不同的微生物。雖然不同的菌種的保藏方法各有優缺點，但其基本原則相同：選用優良純種和創造一個最有利於菌種休眠的環境，即微生物生長繁殖和代謝受抑且不易突變的環境。這種環境要求幹燥、低溫、缺氧、缺營養、添加保護劑等。

下麵介紹微生物工業菌種常用的保藏方法。

1 ．定期移植低溫保藏法

    將菌種接到培養基斜麵進行斜麵培養或穿刺培養，也可進行液體培養，待長成健壯的菌體（對數期細胞、有性孢子、無性孢子等）後，置於4 ℃ 冰箱保存，間隔一定時間需要重新進行移植培養。例如，細菌通常1 個月移種一次，芽孢杆菌3 -6 個月移種一次，放線菌3 個月移種一次，酵母菌4-6 個月移種一次，絲狀真菌4 個月移種一次。

    定期移植保藏法在工廠和實驗室中普遍使用，具有簡單易行、代價小，且可隨時觀察保藏菌種的死亡、變異、退化或染菌等優點，但因微生物在保藏期間仍有活動，所以存在保藏時間偏短、菌種易退化等不足。不過，酒精酵母經過數十年的移植沒有發現變異或衰退現象。如果用滅菌的橡皮塞代替棉塞，則由於避免了水分的散失且隔絕氧氣而能適當延長保藏期。采用石蠟液封菌體表麵（液封麵高出菌種表麵1cm），同樣能延長保藏期，這就是所謂的液體石蠟保藏法。

2 ．液氮超低溫保藏法

    此法被公認為最有效和適用範圍最廣的菌種長期保藏技術之一，需要液氮罐或液氮冰箱、圓底安瓶管或塑料液氮保藏管。由於保藏采用低溫-196～-150℃ ，必須按照“先慢後快”的原則進行操作。具體操作步驟如下：
( 1 ）將10%甘油或二甲亞碸作為保護劑分裝於安瓿瓶中；

( 2 ）將長有菌落的瓊脂懸浮於已滅菌的保護劑中；

( 3 ）熔封安瓿瓶口；

( 4 ）以1min下降1 ℃ 的速度降至-35 ℃ ，使瓶內懸浮液體凍結，然後將安瓶瓶置液氮冰箱中，於-130℃ 以下儲藏；

( 5 ）恢複培養時，從液氮中取出安瓿瓶，立即於38-40 ℃ 水浴中搖動，至瓶內的冰全部融化，按常法進行培養。

3 ．甘油低溫保藏法

    與液氮超低溫保藏法類似，采用含10%-30%甘油的蒸餾水懸浮菌種，置於-80～-70 ℃ 溫度下保藏，因此需要超低溫冰箱。該法保藏期一般在1 年以上，特別適於基因工程菌株的保藏。

4．沙土保藏法

    此法適於芽孢杆菌、放線菌、曲黴菌等的保藏，保藏方法簡單，主要過程如下：土壤（河沙需要10%-20% H Cl 溶液洗去有機質）經風幹、過24 目篩、分裝滅菌後，加入10 滴置備好的細胞或孢子懸液，然後在幹燥器中吸幹水分，再用火焰熔封管口，在室溫或低溫下可保藏數年。

5 ．麩皮保藏法

    麩皮保藏法又稱為曲法保藏，常用於放線菌、黴菌等的保藏。將麩皮或其他穀物與培養基或水按一定比例（按菌種要求而定，一般質量比為1：1 ）拌勻，分裝、滅菌後加入菌種培養，至長出菌絲，用幹燥器幹燥後在溫度20 ℃ 條件下可長期保藏而不退化，故工廠經常采用。

6 ．蒸餾水保藏法

    此法是20世紀50年代開始采用的最簡單的菌種保藏法，適用於酵母、真菌等。其原理是創造一個無營養的環境，在4-10 ℃ 下可較長時間保藏菌種。

7 ．冷凍幹燥保藏法

    冷凍幹燥保藏法是非常有效的菌種保藏法，采用幹燥、低溫、缺氧的條件保藏菌種，但需要冷凍幹燥機等設備，操作複雜，菌種存活率的影響因素多，故其應用受限，主要在專業菌種保存單位采用。

四、菌種選育

    菌種選育就是按照生產的要求，以微生物遺傳變異理論為依據，采用人工方法使菌種發生變異，再用各種篩選方法篩選出符合要求的目的菌種。菌種選育的目的包括改善菌種特性，以提高產量、改進質量、降低成本、改革工藝、方便管理及綜合利用。選育菌種的基本方法包括自然選育、抗噬菌體選育、誘變育種、代謝控製育種、基因定向育種等一係列方法。

   誘變育種是采用物理、化學誘變因素使微生物DNA 上的堿基發生改變，而排列錯誤的D NA 模板形成異常的遺傳信息，造成某些蛋白結構變異，導致細胞功能的改變。

代謝調控育種主要包括改變代謝通路的育種、改變自我代謝調節係統的育種。

基因定向育種主要是通過轉化、轉導、轉染、雜交等手段有目的地增加、增強或取消、減弱某個或某些基因，從而得到需要的工程菌株。

有關育種的具體方法在微生物學中已有詳細介紹，這裏不再贅述。

五、防止菌種退化的措施

菌種退化是指整個菌體在多次接種傳代過程中逐漸造成菌種發酵力（如糖、氮的消耗）或繁殖力（如孢子的產生）下降或發酵產物得率降低的現象。對此，首先要鑒定是否由於染菌引起產量下降或菌種生長延緩，可直接進行鏡檢判斷或采用劃線分離來確定是染菌還是菌種退化；其次要判斷是否由於培養條件引起的暫時性變化，可通過培養幾批菌種觀察生長代謝情況來確定。

菌種退化的原因有兩方麵：一是菌種保藏不妥；二是菌種生長的要求沒有得到滿足，例如，遇到某些不利的條件，或失去某些需要的條件，或誘變型新菌株發生回複突變而喪失新的特性。

如果發現菌株已經發生退化，產量下降，則要進行分離複壯。因為在菌種發生衰退的時候，並不是所有的菌體都衰退，其中未衰退的菌體往往是經過環境考驗的、具有更強生命力的菌體。因此，采用單細胞菌株分離的措施，即用稀釋平板法或平板劃線法，以取得單細胞長成的菌落，再通過菌落和菌體的特征分析和性能測定，就可獲得具有原來性狀的菌株，甚至性狀更好的菌株。對於某些菌種，還可配合其他辦法分離單細胞菌株，如對芽孢杆菌，可先將菌液用沸水處理數分鍾，再用平板進行分離，從所剩的孢子中挑選出最優的菌體來。

如果遇到某些菌株，即使進行單細胞分離仍不能達到複壯的效果，則可改變培養條件，以達到複壯的目的。例如，AT3.942 棲土曲黴的產孢子能力下降，可適當提高培養溫度，恢複其能力。同時，通過實驗選擇一種有利於高產菌株而不利於低產菌株的培養條件，能夠得到產量較高的菌株。如果將單菌落分離和一定的培養條件相結合進行複壯，則更為有效。

此外，產生退化現象的原因多為基因突變，所以使用誘變劑處理，對退化類型的菌株具有殺傷力，則經誘變劑處理後再進行單菌落分離，就可得到複壯的菌株。同樣道理，其他不具誘變作用的物理和化學因素也可用於複壯處理，但需針對具體菌種進行具體分析，以采用最佳的複壯方法。

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