支原體培養基

[用途]

分離支原體

[配法]

牛心（去脂絞碎）250g ，氯化鈉5g，胰蛋白酶（不含乳糖）2.5g，蛋白腖10g ，酵母浸膏1g ，瓊脂粉14g ，蒸餾水1L。

（1）    牛心消化液配製：取去脂絞碎牛心250g ，氯化鈉5g及蒸餾水900ml混合；另取胰蛋白酶2.5g，溶解於100ml 5g / L 氯化鈉溶液中，然後與上述牛心消化液混合，放置50-60 ℃ 水溫箱內消化2h ，中間不斷攪拌消化後用兩層紗布過濾，濾液煮沸5min ，用濾紙過濾後，補足水分至原量，然後加酵母浸膏1g ，混勻，冷卻後調pH 至8.0 ，分裝後121 ℃ 滅菌15min 備用。

（2）    支原體基礎瓊脂：取上述牛心消化液（已加氯化鈉）1L，加蛋白腖10g 和瓊脂粉14g ，混合後，加熱溶解調pH 至7.8-8.0，再加熱煮沸，用脫脂棉或絨布過濾，過濾後分裝於圓瓶中，每瓶70ml，121 ℃ 滅菌15min 備用

（3）    250g / L 鮮酵母液製備：食用鮮酵母塊250g ，加蒸餾水1L ，混合後，煮沸2min ，用濾紙過濾，濾後置4 ℃ 冰箱中過夜，使之沉澱，次日吸取上清液，用150g / L 氫氧化鈉溶液調pH 至8.0，再煮沸1 次，冷卻後，3000r／min 離心45min ，吸取上清液，分裝於瓶中，121 ℃ 滅菌15min ，放4 ℃ 冰箱中備用，可保存3 月。

（4）    傾注平板：溶解基礎瓊脂，冷卻至80 ℃ 左右，每瓶（70ml）內立即加預溫在37℃ 培養箱內的無菌馬血清或小牛血清20ml , 250g / L 鮮酵母浸出液10ml，10g / L 乙酸鉈溶液2.5ml ，青黴素G 鉀鹽溶液（20 萬U / ml )0.5ml 和兩性黴素B 溶液（5mg／ml）0.1ml；充分混勻後傾注9cm平板，經37℃ 培養過夜，無菌試驗陰性者，存放4 ℃ 冰箱備用

注：

(1)乙酸鉈是極毒藥品，須特別注意安全操作

(2)   支原體美藍瓊脂平皿為分離肺炎支原體的選擇性平皿，口腔、唾液分泌物中的其它支原體均被抑製生長，肺炎支原體生長為“桑椹狀”無色的菌落

(3)   支原體傳代、移種用0.1 ％半固體瓊脂，配製時除用0.1 ％瓊脂粉外，其它成分與支原體基礎培養基相同，但不加兩性黴素，此半固體瓊脂分裝在試管內滅菌備用。傳代時將平皿上已選定的支原體菌落用無菌刀片切下一小塊，直接移種於半固體管中，置適當的氣體環境中，培養3-5 天後，可在瓊脂小塊出現“小島狀”絮片生長物，或呈顆粒狀，即次代支原體

(4)   支原體傳代用液體培養基：其成分與上述支原體半固體瓊脂相同，不加瓊脂粉和兩性黴素B 。

2 肺炎支原體分離用雙相培養基

[用途]

用於喉拭標本直接分離肺炎支原體

[配法]

(1)底層瓊脂斜麵：其成分與上述支原體半固體瓊脂相同，不加兩性黴素B 。無菌分裝於經滅菌的鏈黴素空瓶中，每瓶3ml，置成斜麵，此為底層

(2)   液體培養基：其成分與上述支原體傳代用液體培養基相同。但在未高壓滅菌前，再加入葡萄糖1g ，美藍0.001g （即10g / L 美藍溶液0.lml）, 1g / L 酚紅溶液2ml , 115 ℃ 滅菌15min ，冷卻後，再加入輔助成分和防止雜菌生長的成分。然後，在上述底層瓊脂斜麵上，每瓶再加入液體培養基3-5ml，瓶塞用煮沸滅菌的後口橡皮塞經37℃ 培養過夜，無菌試驗陰性者，存放4 ℃ 冰箱中備用，可保存1 月

注：已接種的雙相培養管，培養37℃ 普通環境2-4 周，觀察結果，陽性生長見雙相管由淡紫色變成綠色再轉變為黃色，因肺炎支原體發酵葡萄糖，還原美藍。取陽性管用分離支原體固體平皿分離菌落，平血放入含95 ％氮氣和5 ％二氧化碳環境中，或放入含5%二氧化碳環境中培養2-4 周，陽性平皿可見菌落生長

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