染菌的檢查和判斷

發酵過程中的種子培養和發酵的異常現象是指發酵過程中的某些物理參數、化學參數或生物參數發生與原有規律不同的改變，這些改變必然影響發酵水平，使生產蒙受損失。對此，應及時查明原因，加以解決。

 

種子培養異常表現在培養的種子質量不合格。種子質量差會給發酵帶來較大的影響。然而種子內在質量常被忽視，由於種子培養的周期短，可供分析的數據較少，因此種子異常的原因一般較難確定，也使得由種子質量引起的發酵異常原因不易查清。種子培養異常的表現主要有菌體生長緩慢、菌絲結團、菌體老化以及培養液的理化參數變化。

 

(1)菌體生長緩慢  種子培養過程中菌體數量增長緩慢的原因很多。培養基原料質量下降、菌體老化、滅菌操作失誤、供氧不足、培養溫度偏高或偏低、酸堿度調節不當等都會引起菌體生長緩慢。此外，接種物冷藏時間長或接種量過低而導致菌體量少，或接種物本身質量差等也都會使菌體數量增長緩慢。

 

(2)菌絲結團  在培養過程中有些絲狀菌容易產生菌絲團，菌體僅在表麵生長，菌絲向四周伸展，而菌絲團的中央結實，使內部菌絲的營養吸收和呼吸受到很大影響，從而不能正常地生長。菌絲結團的原因很多，諸如通氣不良或停止攪拌導致溶解氧濃度不足；原料質量差或滅菌效果差導致培養基質量下降；接種的孢子或菌絲保藏時間長而菌落數少，泡沫多；罐內裝料小、菌絲粘壁等會導致培養液的菌絲濃度比較低；此外接種物種齡短等也會導致菌體生長緩慢，造成菌絲結團。

 

(3)代謝不正常  代謝不正常表現出糖、氨基氮等變化不正常，菌體濃度和代謝產物不正常。造成代謝不正常的原因很複雜，除與接種物質量和培養基質量差有關外，還與培養環境條件差、接種量小、雜菌汙染等有關。

 

不同種類的發酵過程所發生的發酵異常現象，形式雖然不盡相同，但均表現出菌體生長速度緩慢、菌體代謝異常或過早老化、耗糖慢、pH值的異常變化、發酵過程中泡沫的異常增多、發酵液顏色的異常變化、代謝產物含量的異常下跌、發酵周期的異常拖長、發酵液的黏度異常增加等。

 

 (1)菌體生長差  由於種子質量差或種子低溫放置時間長導致菌體數量較少、停滯期延、發酵液內菌體數量增長緩慢、外形不整齊。種子質量不好、菌種的發酵性能差、環境條件差、培養基質量不好、接種量太少等均會引起糖、氮的消耗少或間歇停滯，出現糖、氮代謝緩慢現象。

 

(2)pH值過高或過低  發酵過程中由於培養基原料質量差、滅菌效果差、加糖、加油過多或過於集中，將會引起pH值的異常變化。而pH值變化是所有代謝反應的綜合反映，在發酵的各個時期都有一定規律，pH值的異常變化就意味著發酵的異常。

 

(3)溶解氧水平異常  根據發酵過程出現的異常現象如溶解氧、pH值、排氣中的CO2含量以及微生物菌體酶活力等的異常變化來檢查發酵是否染菌。對於特定的發酵過程要求一定的溶解氧水平，而且在不同的發酵階段其溶解氧的水平也是不同的。如果發酵過程中的溶解氧水平發生了異常的變化，一般就是發酵染菌發生的表現。

 

在正常的發酵過程中，發酵初期菌體處於適應期，耗氧量很少，溶解氧基本不變；當菌體進入對數生長期，耗氧量增加，溶解氧濃度很快下降，並且維持在一定的水平，在這階段中操作條件的變化會使溶解氧有所波動，但變化不大；而到了發酵後期，菌體衰老，耗氧量減少，溶解氧又再度上升；當感染噬菌體後，生產菌的呼吸作用受抑製，溶解氧濃度很快上升。發酵過程感染噬菌體後，溶解氧的變化比菌體濃度更靈敏，能更好地預見染菌的發生。

 

由於汙染的雜菌好氧性不同，產生溶解氧異常的現象也是不同的。當雜菌是好氧性微生物時，溶解氧的變化是在較短時間內下降，直到接近於零，且在長時間內不能回升；當雜菌是非好氧性微生物，而生產菌由於受汙染而抑製生長，使耗氧量減少，溶解氧升高。對於特定的發酵過程，工藝確定後，排出的氣體中C02含量的變化是規律的。染菌後，培養基中糖的消耗發生變化，引起排氣中C02含量的異常變化，如雜菌汙染時，糖耗加快，C02含量增加，噬菌體汙染後，糖耗減慢，C02含量減少。因此，可根據C02含量的異常變化來判斷是否染菌。

 

(4)泡沫過多  一般在發酵過程中泡沫的消長是有一定的規律的。但是，由於菌體生長、代謝速度慢、接種物嫩或種子未及時移種而過老、蛋白質類膠體物質多等都會使發酵液在不斷通氣、攪拌下產生大量的泡沫。除此之外，培養基滅菌時溫度過高或時間過長，葡萄糖受到破壞後產生的氨基糖會抑製菌體的生長，也會使泡沫大量產生，從而使發酵過程的泡沫發生異常。

 

(5)菌體濃度過高或過低  在發酵生產過程中菌體或菌絲濃度的變化是按其固有的規律進行的。但是如罐溫長時間偏高，或停止攪拌時間較長造成溶氧不足，或培養基滅菌不當導(營養條件較差，種子質量差菌體或菌絲自溶等均會嚴重影響到培養物的生長，導致發酵液，菌體濃度偏離原有規律，出現異常現象。

 

發酵過程是否染菌應以無菌試驗的結果為依據進行判斷。在發酵過程中，如何及早發現雜菌的汙染並及時采取措施加以處理，是避免染菌造成嚴重經濟損失的重要手段。因此，生產上要求能準確、迅速的檢查出雜菌的汙染。目前常用於檢查是否染菌的無菌試驗方法主要有顯微鏡檢查法、肉湯培養法、平板培養法、發酵過程的異常觀察法等。 

 

用革蘭染色法(Gramsstain)對樣品進行塗片、染色，然後在顯微鏡下觀察微生物的形態特征，根據生產菌與雜菌的特征進行區別、判斷是否染菌。如發現有與生產菌形態特征不一樣的其他微生物的存在，就可判斷為發生了染菌。此法檢查雜菌最為簡單、最直接，也是最常用的檢查方法之一。必要時還可進行芽孢染色或鞭毛染色。

 

通常用組成為0.3％牛肉膏、0.5％葡萄糖、0.5％氯化鈉、0.8％蛋白腖、0.4％的酚紅溶液(pH=7．2)的葡萄糖酚紅肉湯作為培養基，將待檢樣品直接接人經完全滅菌後的肉湯培養基中，分別於37℃、27℃進行培養，隨時觀察微生物的生長情況，並取樣進行鏡檢，判斷是否有雜菌。肉湯培養法常用於檢查培養基和無菌空氣是否帶菌，同時此法也可用於噬菌體的檢查。

 

將待檢樣品在無菌平板上劃線，分別於37℃、27℃進行培養，一般24h後即可進行鏡檢觀察，檢查是否有雜菌。有時為了提高平板培養法的靈敏度，也可以將需要檢查的樣品先置於37℃條件下培養6h，使雜菌迅速增殖後再劃線培養。

 

無菌試驗時，如果肉湯連續三次發生變色反應(由紅色變為黃色)或產生混濁，或平板培養連續三次發現有異常菌落的出現，即可判斷為染菌。有時肉湯培養的陽性反應不夠明顯，而發酵樣品的各項參數確有可疑染菌，並經鏡檢等其他方法確認連續三次樣品有相同類型的異常菌存在，也應該判斷為染菌。一般來講，無菌試驗的肉湯或培養平板應保存並觀察至本批(罐)放罐後12h，確認為無雜菌後才能棄去。無菌試驗期間應每6h觀察一次無菌試驗樣品，以便能及早發現染菌。

 

（三）各種檢查方法的比較

顯微鏡檢查方法簡便、快速，能及時發現雜菌，但由於鏡檢取樣少，視野的觀察麵也小，因此不易檢出早期雜菌。平板劃線法和肉湯培養方法的缺點是需經較長時間培養(一般要過夜)才能判斷結果，且操作較繁瑣，但它要比顯微鏡能檢出更少的雜菌，而且結果也更為準確。

 

（四）雜菌檢查中的問題

檢查結果應以平板劃線和肉湯培養結果為主要根據；平板劃線和肉湯培養應做三個平行樣；要定期取樣；酚紅肉湯和平板劃線培養樣品應保存至放罐後12小時，確定為無菌時方可棄去；取樣時要防止外界雜菌混入。

 

（五）檢查的工序和時間

選擇哪些生產工序和時間的樣品檢查也是十分重要的問題。科學合理的選擇檢查工序和時間，對於除去已汙染雜菌的物料，避免下道工序再遭染菌，有著直接的指導意義。有時即使由於檢查時間較長，未能及時據導本批生產，但對於找出造成染菌事故的環節，分析染菌原因，杜絕染菌漏洞也是不可缺少的。

 

由於生產菌種相產品的不同，檢查的時間也不完全一樣：但總的原則是一致的，即每個工序或經一定時間都應進行取樣檢查。