微生物工業菌種的擴大培養

 

實驗室種子的製備一般采用兩種方式：固體孢子培養法和液體種子培養法。對於產孢子能力強的及孢子發芽、生長繁殖快的菌種可以采用固體培養基培養孢子，孢子可直接作為種子罐的種子，這樣操作簡便，不易汙染雜菌；對於產孢子能力不強或孢子發芽慢的菌種，可以用液體培養法。  

 

１、孢子的製備

（1）細菌的製備

細菌的斜麵培養基多采用碳源限量而氮源豐富的配方，培養溫度一般為37˚C。細菌菌體培養時間一般為1~2天，產芽孢的細菌培養則需要5~10天。

（2）黴菌孢子的製備

黴菌孢子的培養一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農產品為培養基，培養的溫度一般為25~28˚C，培養時間一般為4~14天。

（3）放線菌孢子的製備

放線菌的孢子培養一般采用瓊脂斜麵培養基，培養基中含有一些適合產孢子的營養成分，如麩皮、豌豆浸汁、蛋白腖和一些無機鹽等，培養溫度一般為28˚C，培養時間為5~14天。

 

２、液體種子製備

（1）好氧培養：

    對於產孢子能力不強或孢子發芽慢的菌種，可以用搖瓶液體培養法。將孢子接入含液體培養基的搖瓶中，於搖瓶機上恒溫振蕩培養，獲得菌絲體，作為種子。試管→三角瓶→搖床→種子罐 。

（2）厭氧培養：對於酵母菌，試管→三角瓶→卡式罐→種子罐 。

 

實驗室製備的孢子或液體種子移種至種子罐擴大培養，種子罐的培養基雖因不同菌種而異，但其原則為采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米漿、磷酸鹽等，如果是需氧菌，同時還需供給足夠的無菌空氣，並不斷攪拌，使菌（絲）體在培養液中均勻分布，獲得相同的培養條件。

 

 

1、種子罐的作用

主要是使孢子發芽，生長繁殖成菌（絲）體，接入發酵罐能迅速生長，達到一定的菌體量，以利於產物的合成。

 

種子罐級數是指製備種子需逐級擴大培養的次數。種子罐的級數取決於菌種生長特性、孢子發芽及菌體繁殖速度、所采用發酵罐的容積等。對於細菌來說，菌體生長快，種子用量比例少，級數也較少，一般采用二級發酵，即茄子瓶→種子罐→發酵罐。對於黴菌來說，黴菌生長較慢，如青黴菌，需要三級發酵，即孢子懸浮液→一級種子罐（27˚C,40小時孢子發芽，產生菌絲）→二級種子罐（27˚C,10~24小時，菌體迅速繁殖，粗壯菌絲體）→發酵罐。對於放線菌來說，放線菌生長更慢，采用四級發酵。對於酵母菌來說，酵母生長比細菌慢，比黴菌，放線菌快，通常用一級種子。 

 

確定種子罐級數需注意一些問題。種子級數越少越好，可簡化工藝和控製，減少染菌機會。但種子級數太少，接種量小，發酵時間延長，降低發酵罐的生產率，增加染菌機會。雖然種子罐級數隨產物的品種及生產規模而定。但也與所選用工藝條件有關。如改變種子罐的培養條件，加速了孢子發芽及菌體的繁殖，也可相應地減少種子罐的級數。 

 

（一）、影響孢子質量的因素及控製

 

生產過程中經常出現種子質量不穩定的現象，其主要原因是原材料質量波動。例如在四環素、土黴素生產中，配製產孢子斜麵培養基用的麩皮，因小麥產地、品種、加工方法及用量的不同對孢子質量的影響也不同。原材料質量的波動，起它要作用的是其中無機離子含量不同，如微量元素Mg²⁺  、Cu²⁺  、Ba²⁺ 能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也會影響孢子的質量。水質對孢子的質量也有影響，地區不同、季節變化和水源汙染，均可造成水質波動，影響種子質量。

 

 

    溫度對多數品種斜麵孢子質量有顯著的影響。一般各生產單位都嚴格控製孢子子斜麵的培養溫度。

    製備斜麵孢子培養基的濕度對孢子的數量和質量有較大的影響。

 

一般來說，衰老的孢子不如年輕的孢子，因為衰老的孢子已在逐步進入發芽階段，核物質趨於分化狀態。過於衰老的孢子會導致生產能力的下降。控製措施是孢子培養的時間應該控製在孢子量多、孢子成熟、發酵產量正常的階段終止培養。

斜麵冷藏對孢子質量的影響與孢子成熟程度有關。如土黴素生產菌種孢子斜麵培養4天左右即於4˚C冰箱保存，發現冷藏7~8天菌體細胞開始自溶。而培養5天以後冷藏，20天未發現自溶。

冷藏時間對孢子的生產能力也有影響。例如在鏈黴素生產中，斜麵孢子在6˚ C冷藏兩個月後的發酵單位比冷藏一個月降低18%，冷藏3個月後降低35%。

 

 

    培養基的營養成分要適合種子培養的需要，選擇有利於孢子發芽和菌體生長的培養基；營養上要易於被菌體直接吸收和利用；營養成分要適當豐富和完全，氮源和維生素含量要高，營養成分要盡可能與發酵培養基相近。

 

（1）溫度

（2）通氣量

   在種子罐中培養的種子除保證供給易被利用的培養基外，有足夠的通氣量可以提高種子質量。

 

種齡是指種子罐中培養的菌絲體開始移入下一級種子罐或發酵罐時的培養時間。通常種齡是以處於生命力極旺盛的對數生長期，菌體量還未達到最大值時的培養時間較為合適。時間太長，菌種趨於老化，生產能力下降，菌體自溶；種齡太短，造成發酵前期生長緩慢。不同菌種或同一菌種工藝條件不同，種齡是不一樣的，一般需經過多種實驗來確定。

 

接種量是指移入的種子液體積和接種後培養液體積的比例。接種量的大小決定於生產菌種在發酵罐中生長繁殖的速度，采用較大的接種量可以縮短發酵罐中菌絲繁殖達到高峰的時間，使產物的形成提前到來，並可減少雜菌的生長機會。但接種量過大或者過小，均會影響發酵。過大會引起溶氧不足，影響產物合成；而且會過多移入代謝廢物，也不經濟；過小會延長培養時間，降低發酵罐的生產率。

 

包括菌絲形態、菌絲濃度和培養液外觀（色素、顆粒等。單細胞要求菌體健壯、菌形一致、均勻整齊，有的還要求有一定的排列或形態；黴菌、放線菌：菌絲粗壯、對某些染料著色力強、生長旺盛、菌絲分枝情況和內含物情況好。

 

包括種子液的糖、氮、磷的含量和pH變化、產物生成量、酶活力。

在抗生素發酵中，產物生成量是考察種子質量的重要指標，因為種子液中產物生成量的多少間接反映種子的生產能力和成熟程度。種子液中某種酶的活力，與目的產物的產量有一定的關聯。