菌種保藏、衰退及複壯（2）

 

菌種衰退（degeneration）是指菌種經過長期人工培養或保藏，由於自發突變的作用而引起某些優良特性變弱或消失的現象。菌種衰退的具體表現有以下幾個方麵：

 

1、菌落和細胞形態改變。每一種微生物在一定的培養條件下都有一定的形態特征，如果典型的形態特征逐漸減少，就表現為衰退。

2、生長速度緩慢，產孢子越來越少

3、代謝產物生產能力的下降，即出現負突變。

4、致病菌對宿主侵染能力下降。

5、對外界不良條件（包括低溫、高溫或噬菌體侵染等）抵抗能力的下降等。

值得指出的是，有時培養條件的改變或雜菌汙染等原因會造成菌種衰退的假象，因此在實踐工作中一定要正確判斷菌種是否退化，這樣才能找出正確的解決辦法。

 

菌種衰退不是突然發生的，而是從量變到質變的逐步演變過程。開始時，在群體細胞中僅有個別細胞發生自發突變（一般均為負變），不會使群體菌株性能發生改變。經過連續傳代，群體中的負變個體達到一定數量，發展成為優勢群體，從而使整個群體表現為嚴重的衰退。經分析發現，導致這一現象的原因有以下幾方麵。

 

（1）有關基因發生負突變導致菌種衰退

菌種衰退的主要原因是有關基因的負突變。如果控製產量的基因發生負突變，則表現為產量下降；如果控製孢子生成的基因發生負突變，則產生孢子的能力下降。菌種在移種傳代過程中會發生自發突變。雖然自發突變的幾率很低(一般為10^-6～10^-9)，尤其是對於某一特定基因來說，突變頻率更低。但是由於微生物具有極高的代謝繁殖能力，隨著傳代次數增加，衰退細胞的數目就會不斷增加，在數量上逐漸占優勢，最終成為一株衰退了的菌株。

 

（2）表型延遲造成菌種衰退

表型延遲現象也會造成菌種衰退。如，在誘變育種過程中，經常會發現某菌株初篩時產量較高，進行複篩時產量卻下降了。

 

（3）質粒脫落導致菌種衰退

質粒脫落導致菌種衰退的情況在抗生素生產中較多，不少抗生素的合成是受質粒控製的。當菌株細胞由於自發突變或外界條件影響（如高溫），致使控製產量的質粒脫落或者核內DNA和質粒複製不一致，即DNA複製速度超過質粒，經多次傳代後，某些細胞中就不具有對產量起決定作用的質粒，這類細胞數量不斷提高達到優勢，則菌種表現為衰退。

 

連續傳代是加速菌種衰退的一個重要原因。一方麵，傳代次數越多，發生自發突變（尤其是負突變）的幾率越高；另一方麵，傳代次數越多，群體中個別的衰退型細胞數量增加並占據優勢越快，致使群體表型出現衰退。

 

不適宜的培養和保藏條件是加速菌種衰退的另一個重要原因。不良的培養條件如營養成分、溫度、濕度、pH值、通氣量等和保藏條件如營養、含水量、溫度、氧氣等，不僅會誘發衰退型細胞的出現，還會促進衰退細胞迅速繁殖，在數量上大大超過正常細胞，造成菌種衰退。

 

根據菌種衰退原因的分析,可以製定出一些防治衰退的措施，主要從以下幾方麵考慮：

 

意即盡量避免不必要的移種和傳代，將必要的傳代降低到最低限度，以減少自發突變的機率。

 

創造一個適合原種的良好培養條件，可以防止菌種衰退。如培養營養缺陷型菌株時應保證適當的營養成分，尤其是生長因子；培養一些抗性菌時應添加一定濃度的藥物於培養基中,使回複的敏感型菌株的生長受到抑製，而生產菌能正常生長；控製好碳源、氮源等培養基成分和pH、溫度等培養條件，使之有利於正常菌株生長，限製退化菌株的數量，防止衰退。

 

在放線菌和黴菌中，由於它們的菌絲細胞常含幾個細胞核，甚至是異核體，因此用菌絲接種就會出現不純和衰退，而孢子一般是單核的，用它接種時，就不會發生這種現象。在實踐中，若用滅過菌的棉團輕巧地對放線菌進行斜麵移種，由於避免了菌絲的接入，因而達到了防止衰退的效果；另外，有些黴菌（如構巢曲黴）若用其分生孢子傳代就易衰退，而改用子囊孢子移種則能避免衰退。

 

有效的菌種保藏方法是防止菌種衰退極其必要的措施。在實踐中，應當有針對性的選擇菌種保藏的方法。例如，啤酒釀造中常用的釀酒酵母，保持其優良發酵性能最有效的保藏方法是－70℃低溫保藏，其次是4℃低溫保藏，若采用對於絕大多數微生物保藏效果很好的冷凍幹燥保藏法和液氮保藏法，其效果並不理想。

一般斜麵冰箱保藏法隻適用於短期保藏，而需要長期保藏的菌種，應當采用砂土保藏法、冷凍幹燥保藏法及液氮保藏法等方法。對於比較重要的菌種，盡可能采用多種保藏方法。

 

在菌種選育時，應盡量使用單核細胞或孢子，並采用較高劑量使單鏈突變而使另一單鏈喪失作為模板的能力,避免表型延遲現象。同時，在誘變處理後應進行充分的後培養及分離純化，以保證菌種的純度。

 

定期進行分離純化，對相應指標進行檢查，也是有效防止菌種衰退的方法。此方法將在菌種複壯部分介紹。