菌種保藏、衰退及複壯（1）

微生物在使用和傳代過程中容易發生汙染、變異甚至死亡，因而常常造成菌種的衰退，並有可能使優良菌種丟失。菌種保藏的重要意義就在於盡可能保持其原有性狀和活力的穩定，確保菌種不死亡、不變異、不被汙染，以達到便於研究、交換和使用等諸方麵的需要。

 

無論采用何種保藏方法，首先應該挑選典型菌種的優良純種來進行保藏，最好保藏它們的休眠體，如分生孢子、芽孢等。其次，應根據微生物生理、生化特點，人為地創造環境條件，使微生物長期處於代謝不活潑、生長繁殖受抑製的休眠狀態。這些人工造成的環境主要是幹燥、低溫和缺氧，另外，避光、缺乏營養、添加保護劑或酸度中和劑也能有效提高保藏效果。

 

將菌種接種在適宜的斜麵培養基上，待菌種生長完全後，置於4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定時間（保藏期）再轉接至新的斜麵培養基上，生長後繼續保藏，如此連續不斷。此法廣泛適用於細菌、放線菌、酵母菌和黴菌等大多數微生物菌種的短期保藏及不宜用冷凍幹燥保藏的菌種。放線菌、黴菌和有芽孢的細菌一般可保存6個月左右，無芽孢的細菌可保存1個月左右，酵母菌可保存3個月左右。如以橡皮塞代替棉塞，再用石蠟封口，置於4℃冰箱中保藏，不僅能防止水分揮發、能隔氧，而且能防止棉塞受潮而汙染。這一改進可使菌種的保藏期延長。

 

此法是在無菌條件下，將滅過菌並已蒸發掉水分的液體石蠟倒入培養成熟的菌種斜麵（或半固體穿刺培養物）上，石蠟油層高出斜麵頂端lcm，使培養物與空氣隔絕，加膠塞並用固體石蠟封口後，垂直放在室溫或4℃冰箱內保藏。使用的液體石蠟要求優質無毒，化學純規格，其滅菌條件是：150～170℃烘箱內滅菌lh；或121℃高壓蒸汽滅菌60～80min，再置於80℃的烘箱內烘幹除去水分。

 

由於液體石蠟阻隔了空氣，使菌體處於缺氧狀態下，而且又防止了水分揮發，使培養物不會幹裂，因而能使保藏期達1～2年，或更長。這種方法操作簡單，它適於保藏黴菌、酵母菌、放線菌、好氧性細菌等，對黴菌和酵母菌的保藏效果較好，可保存幾年，甚至長達10年。但對很多厭氧性細菌的保藏效果較差，尤其不適用於某些能分解烴類的菌種。

 

這是一種常用的長期保藏菌種的方法，適用於產孢子的放線菌、黴菌及形成芽孢的細菌，對於一些對幹燥敏感的細菌如奈氏球菌、弧菌和假單胞杆菌及酵母則不適用。

其製作方法是，先將砂與土分別洗淨、烘幹、過篩(一般砂用60目篩，土用120目篩)，按砂與土的比例為(1～2)：1混勻，分裝於小試管中，砂土的高度約1cm，以121℃蒸汽滅菌1～1.5h，間歇滅菌3次。50℃烘幹後經檢查無誤後備用。也有隻用砂或土作載體進行保藏的。需要保藏的菌株先用斜麵培養基充分培養，再以無菌水製成10⁸～10¹⁰個/ml菌懸液或孢子懸液滴入砂土管中，放線菌和黴菌也可直接刮下孢子與載體混勻，而後置於幹燥器中抽真空約2～4h，用火焰熔封管口(或用石蠟封口)，置於幹燥器中，在室溫或4℃冰箱內保藏，後者效果更好。

 

砂土管法兼具低溫、幹燥、隔氧和無營養物等諸條件，故保藏期較長、效果較好，且微生物移接方便，經濟簡便。它比石蠟油封藏法的保藏期長，約1～10年。中國科學院微生物研究所用砂土管保藏法保藏放線菌。

 

麩皮保藏法亦稱曲法保藏。即以麩皮作載體，吸附接入的孢子，然後在低溫幹燥條件下保存。其製作方法是按照不同菌種對水分要求的不同將麩皮與水以一定的比例1：(0.8～1.5)拌勻，裝量為試管體積2/5，濕熱滅菌後經冷卻，接入新鮮培養的菌種，適溫培養至孢子長成。將試管置於盛有氯化鈣等幹燥劑的幹燥器中，於室溫下幹燥數日後移入低溫下保藏；幹燥後也可將試管用火焰熔封，再保藏，則效果更好。

 

此法適用於產孢子的黴菌和某些放線菌，保藏期在1年以上。因操作簡單，經濟實惠，工廠較多采用。中國科學院微生物研究所采用麩皮保藏法保藏曲黴，如米曲黴、黑曲黴、泡盛曲黴等，其保藏期可達數年至數十年。

 

冷凍真空幹燥保藏法又稱冷凍幹燥保藏法，簡稱凍幹法。它通常是用保護劑製備擬保藏菌種的細胞懸液或孢子懸液於安瓿管中，再在低溫下快速將含菌樣凍結，並減壓抽真空，使水升華將樣品脫水幹燥，形成完全幹燥的固體菌塊。並在真空條件下立即融封，造成無氧真空環境，最後置於低溫下，使微生物處於休眠狀態，而得以長期保藏。常用的保護劑有脫脂牛奶、血清、澱粉、葡聚糖等高分子物質。

 

由於此法同時具備低溫、幹燥、缺氧的菌種保藏條件，因此保藏期長，一般達5～15年，存活率高，變異率低，是目前被廣泛采用的一種較理想的保藏方法。除不產孢子的絲狀真菌不宜用此法外，其他大多數微生物如病毒、細菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌等均可采用這種保藏方法。但該法操作比較煩瑣，技術要求較高，且需要凍幹機等設備。

保藏菌種需用時，可在無菌環境下開啟安瓿管，將無菌的培養基注入安瓿管中，固體菌塊溶解後，搖勻複水，然後將其接種於適宜該菌種生長的斜麵上適溫培養即可。

 

液氮超低溫保藏法簡稱液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亞碸等作為保護劑，在液氮超低溫（-196℃）下保藏的方法。其主要原理是菌種細胞從常溫過渡到低溫，並在降到低溫之前，使細胞內的自由水通過細胞膜外滲出來，以免膜內因自由水凝結成冰晶而使細胞損傷。美國ATCC菌種保藏中心采用該法時，把菌懸液或帶菌絲的瓊脂塊經控製致冷速度，以每分鍾下降1℃/min 的速度從0℃直降到-35℃，然後保藏在-150℃～-196℃液氮冷箱中。如果降溫速度過快，由於細胞內自由水來不及滲出胞外，形成冰晶就會損傷細胞。據研究認為降溫的速度控製在(1～10)℃/min，細胞死亡率低；隨著速度加快，死亡率則相應提高。

 

液氮低溫保藏的保護劑，一般是選擇甘油、二甲基亞碸、糊精、血清蛋白、聚乙烯氮戊環、吐溫80等，但最常用的是甘油（10%～20%）。不同微生物要選擇不同的保護劑，再通過試驗加以確定保護劑的濃度，原則上是控製在不足以造成微生物致死的濃度。

 

此法操作簡便、高效、保藏期一般可達到15年以上，是目前被公認的最有效的菌種長期保藏技術之一。除了少數對低溫損傷敏感的微生物外，該法適用於各種微生物菌種的保藏，甚至連藻類、原生動物、支原體等都能用此法獲得有效的保藏。此法的另一大優點是可使用各種培養形式的微生物進行保藏，無論是孢子或菌體、液體培養物或固體培養物均可采用該保藏法。其缺點是需購置超低溫液氮設備，且液氮消耗較多，操作費用較高。

 

要使用菌種時，從液氮罐中取出安瓿瓶，並迅速放到35～40℃溫水中，使之冰凍熔化，以無菌操作打開安瓿瓶，移接到保藏前使用的同一種培養基斜麵上進行培養。從液氮罐中取出安瓿瓶時速度要快，一般不超過1min，以防其他安瓿瓶升溫而影響保藏質量。並且取樣時一定要戴專用手套以防止意外爆炸和凍傷。

 

單位簡稱	單 位 名 稱	單位簡稱	單 位 名 稱
CCCCM	中國微生物菌種保藏管理委員會	NICPBP	衛生部藥品生物製品檢定所
CGMCC	中國普通微生物菌種保藏中心	－	中國預防醫學科學院病毒研究所
AS	中國科學院微生物研究所	CACC	中國抗生素微生物菌種保藏中心
AS-IV	中國科學院武漢病毒研究所	IEM	中國醫學科學院醫學生物學研究所
ACCC	中國農業微生物菌種保藏中心	SIA	四川抗生素研究所
ISF	中國農業科學院土壤與肥料研究所	IANP	石家莊華北製藥廠抗生素研究所
CICC	中國工業微生物菌種保藏中心	CVCC	中國獸醫微生物菌種保藏中心
IFFI	中國食品發酵工業研究院	NCIVBP	農業部獸藥監察研究所
CMCC	中國醫學微生物菌種保藏中心	CFCC	中國林業微生物菌種保藏中心
ID	中國醫學科學院皮膚病研究所	RIF	中國林業科學院林業研究所

 

單位簡稱	單位名稱	單位簡稱	單位名稱
ATCC	美國典型培養物收藏中心	NCTC	國家典型菌種保藏中心（英國）
NRRL	北方開發利用研究部（美國）	IAM	東京大學應用微生物研究所(日本)
CBS	黴菌中心保藏所（荷蘭）	CCTM	法國典型微生物保藏中心
NCIB	英國國立工業細菌菌庫	CMI	英聯邦真菌研究所
IFO	大阪發酵研究所（日本）	SSI	國立血清研究所
ATCC	美國典型培養物收藏中心	WHO	世界衛生組織