工業微生物菌種的選育——營養缺陷型菌株的篩選

關於菌株的幾個概念：野生型菌株：從自然界分離到的微生物在其發生突變前的原始狀態。

營養缺陷型：野生型菌株經過人工誘變或自然突變失去合成某種營養的能力，隻有在基本培養基中補充所缺乏的營養因子才能生長。原養型：營養缺陷型菌株經回複突變或重組後產生的菌株，其營養要求在表型上和野生型相同

 

關於培養基：基本培養基（minimal medium，MM）：僅能滿足微生物野生型菌株生長需要的培養基，用[－]來表示。完全培養基（complete medium，CM）：凡可滿足一切營養缺陷型菌株營養需要的天然或半組合培養基。用[＋]來表示。補充培養基（supplemental medium，SM）：凡隻能滿足相應的營養缺陷型生長需要的組全培養基，它是在基本培養基中加入該菌株不能合成的營養因子而組成。

 

一般經誘變後，再經中間培養、淘汰野生型、檢出營養缺陷型、確定生長譜等。

1、營養缺陷型的誘發

    營養缺陷型的誘變方法和誘變因子與普通誘變育種基本相同。

    在誘變後的存活菌體中營養缺陷型菌株的數量很少，一般僅占存活菌體的百分之幾或千分之幾，而野生型細胞卻大量存在，因而要采取一些措施，盡量淘汰野生型細胞，使缺陷型菌株得以富集，以利於檢出。

細菌用青黴素法：細菌細胞壁的主要成分為肽聚糖，而青黴素能抑製細胞壁肽聚糖鏈之間的交鏈，阻止合成完整的細胞壁。處在生長繁殖過程的細菌對青黴素十分敏感，因而被抑製或殺死，但不能抑製或殺死處休止狀態的細菌。將誘變處理後的菌懸液分離加有抗生素的基本培養基上，培養後野生型細胞由於正常生長繁殖而被殺死，營養缺陷型細胞因不能生長而被保留下來，達到富集目的。酵母菌用製黴素法：製黴素作用於真菌細胞膜上的甾醇，引起細胞膜的損傷，殺死生長繁殖過程的真菌，起到富集營養缺陷型的作用。

    真菌和放線菌等絲狀菌的野生型孢子在基本培養基中能萌發長成菌絲，而營養缺陷型的孢子則不能萌發。把誘變處理後的孢子移入到基本培養液中，振蕩培養10h左右，使野生型孢子萌發的菌絲剛剛肉眼可見，用滅菌的脫脂棉、濾紙或玻璃漏鬥除去菌絲。繼續培養，每隔3~4h過濾一次，重複3~4次，最大限度地除去野生型細胞。然後稀釋、塗皿分離。

    利用芽孢杆菌類的芽孢和營養體對熱敏感性的差異，讓誘變後的細菌形成芽孢，然後把處在芽孢階段的細菌移到基本培養液中，振蕩培養一定時間，野生型芽孢萌發，而營養缺陷型芽孢不能萌發。此時將培養物加熱到80℃，維持一定時間，野生型細胞大部分被殺死，缺陷型則得以保留，起到了濃縮作用。

誘變後的孢子或菌體，經富集培養，塗布分離在完全培養基平板進行培養，待菌落孢子成熟後，用滅菌的牙簽或接種針把每個菌落上孢子或菌體分別接到基本培養基和完全培養基平板上的相應位置，同時培養，然後觀察對比菌落生長情況。如果基本培養基上不生長而完全培養基相應位置上生長的菌落，可能為營養缺陷型。挑取孢子或菌體分別移接到基本培養基和完全培養基斜麵上，進一步複證。該法可靠性強，但工作量大。

經富集後的孢子或菌體分離在完全培養基培養至菌落成熟（母皿），用滅菌後的特製“絲絨印模”在母皿平板菌落上輕輕一印，再轉印到方位相同的另一基本培養基和完全培養基的平板上。培養後觀察比較菌落生長情況，凡是在基本培養基上不生長，而在完全培養基上生長的菌落，分別移接到以上兩種培養基斜麵上進一步複證。另外還可采用更簡便的方法，以上印模從母皿中沾上菌體細胞後，僅影印在基本培養基平板上，培養後，生長的菌落情況與存放於冰箱的母皿菌落比較即可檢出營養缺陷型。本法適用於細菌、酵母菌，其次對小型菌落的放線菌和黴菌也適用。

如果試驗的目的僅是檢出營養缺陷型菌株，則其該法是將富集培養後的細胞接種到含有0.01%蛋白腖的基本培養基上，培養後，野生型細胞迅速地長成大菌落，在平皿底部作好顏色標記，而生長緩慢的小菌落可能是缺陷型，此稱限量培養。如果試驗的目的是要定向篩選某種特定的缺陷型，則可在基本培養基中加入某種單一的氨基酸、維生素或堿基等物質，稱為補充培養。

先在培養皿上倒一薄層基本培養基，凝固後再倒一層經過誘變處理的菌液，其上再澆一層基本培養基；經培養後，對首次出現的菌落用記號筆在皿底標記，然後再倒一層完全培養基，再培養，出現的形態較小的新菌落，多為缺陷型。