突變菌株分離和篩選方法
(1)、隨機篩選
又稱搖瓶篩選,該法主要是隨機挑選的平板菌落進行搖瓶篩選,做法是:將誘變處理後的菌體分離在瓊脂平板上,培養後隨機挑選菌落,一個菌落移入一支斜麵,一個斜麵的菌體接入一隻三角瓶,振蕩培養,根據測定產物活性,決定取舍。優點是發酵過程的生產條件、生理條件與大規模生產條件相近,可以模擬進行。
(2)、平板菌落預篩
A、根據形態篩選突變株
部分微生物菌株經過誘變處理後,變異菌株的菌落形態與生理特性、生產性能變化有一定的相關性。
B、根據平板菌落生化反應篩選變株
透明圈法、呈色圈法、抑菌圈法、渾濁圈法等。
C、采用冷敏感菌篩選抗生素變株
主要用來篩選抗生素產生菌株。冷敏菌:從人的病原菌中經誘變分離出的,在20℃下不能生長。篩選原理:將冷敏菌和誘變後的放線菌孢子懸浮液混合,分離在同一培養基平板上,置於20℃培養3-4天,抗生素產生菌不受幹擾,能正常形成菌落,冷敏菌不生長。當放線菌菌落成熟,並且抗生素產量達高峰,將培養皿移至37℃培養18-24h,冷敏菌迅速生長,而此時在抗生素產生菌落周圍的冷敏菌因生長受到抑製而形成抑菌圈。根據菌落直徑和抑菌圈直徑之比的有效值,可以直接篩選出抗生素高產突變株。
D、濃度梯度法
主要用來篩選抗生素產生菌株。 原理:菌株產生抗生素水平受到它自身所產抗生素數量的製約,耐受性越高,抗生素產生能力也就越強。通常采用雙層法製濃度梯度平板,用塗布法接種,培養後,挑取高濃度抗生素區域的菌落,易於篩選到抗性變株。
搖瓶液體培養
產物活性鑒定
搖瓶初篩階段測定產物的幾種簡便方法。
(1)、瓊脂平板活性圈法
該法是在特製的玻璃框瓊脂平板上進行的,以檢驗菌或底物與一定量的瓊脂製成平板,用專製的打孔器取出瓊脂塊,在留下的圓孔中加入發酵液,或用圓濾紙片浸透發酵液直接覆於瓊脂平板上,在適合溫度下培養一定時間,測量圓孔或濾紙片周圍形成的抑菌圈或水解圈,根據活性圈的大小挑選高產菌株。
(2)、紙片法
隨著誘變代數的增加,有效產物濃度不斷提高,當發酵液中產物濃度相當高時,活性圈大小與產物濃度之間失去線性關係,掩蓋了菌株的高產性能而被漏篩,此時可采用紙片法:取直徑0.5cm圓紙片,滅菌後覆於瓊脂平板上,準確取發酵注1~2ul在濾紙片上,培養20~25h,測量水解圈大小。如果活性圈仍然很大(直徑15mm以上),則可將發酵液稀釋,或增加底物濃度和瓊脂板的厚度,使水解圈控製在一定範圍內。
(3)、瓊脂薄層紙片法
此法適合抗真菌抗生素和農業抗生素野生菌的初篩和誘變菌株的初篩,適合對大量菌株和多種產孢子的真菌、病源菌為對象的綜合篩選。製備檢驗菌的孢子懸液,與真菌固體培養基混勻,傾入玻璃析上,均勻攤平,製成厚度約1mm的薄層瓊脂板,將濾紙片依次覆於薄層瓊脂板上,加入1~2ul發酵液,上蓋一塊過的玻璃板,放入底部有浸濕紗布的盤內,以做便保濕,於適宜的溫度下培養3~4天,觀察孢子萌發、菌絲形態,並測量抑菌圈大小。
培養基和培養條件的調整
一個突變株由於基因突變,失去生理特性的平衡,同時也因此降低了與原來環境條件的適應能力。由於這種環境因素的選擇作用,不適應的突變株優良性狀不能表達,甚至被淘汰。在實際工作中,當篩選到一個優良菌株時,要調整培養基配方和培養條件,使突變株處於一個適應的環境中得到充分表達。
突變株的特性研究與鑒定
研究菌種純度、遺傳穩定性、菌落形態、群體形態、生活能力、產孢能力、保藏培養基和保藏方法;研究碳氮源利用情況、菌絲生長速度、菌絲量、發酵液粘度;最適合接種量、移種量、通氣攪拌、溫度、PH等。從分子水平進一步對突變株的生理生化特性加以鑒定。
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