工業微生物菌種的選育——誘變選育（1）

（二）、誘變育種方案設計

誘變育種方案包括突變的誘發、突變株的篩選和突變高產基因的表現。

 

1、出發菌株的選擇

工業上用來進行誘變處理的菌株，稱為出發菌株。出發菌株選擇目前主要依據實際經驗，總結如下： ①以單倍體純種為出發菌株； ②采用具有優良性狀的菌株；③選擇對誘變劑敏感的菌株；④許多高產突變往往要經過逐步累積的過程，才變得明顯，所以有必要多挑選一些已經過誘變的菌株為出發菌株，進行多步育種，確保高產菌株的獲得。

 

2、出發菌株的純化

為什麽要對出發菌株進行純化呢？這是因為微生物容易發生變異和染菌，同時一般絲狀菌的野生菌株多為異核體。生產菌在不斷移代過程中，菌絲間接觸、吻合後，易產生異核體、部分結合子、雜合二倍體及自然突變株等。這些都會造成細胞內遺傳物質的異質化，使遺傳性狀不穩定。通過純種分離，從中挑選所需的優良菌株。常用劃線分離和稀釋分離法，並結合顯微鏡操縱器分離單孢子。

 

3、單孢子懸液的製備

誘變育種要求所處理的細胞必須是處於對數生長期同步生長的細胞，並且是均勻狀態的單細胞懸液。

首先是細胞的生理狀態對誘變處理也會產生很大的影響，如細菌在對數期誘變處理效果較好；黴菌或放線菌的分生孢子一般都處於休眠狀態，所以培養時間的長短對孢子影響不大，但稍加萌發後的孢子則可提高誘變效率。

其次是分散狀態的細胞可以均勻地接觸誘變劑，又可避免長出不純菌落。由於在許多微生物的細胞內同時含有幾個核，所以即使用單細胞懸浮液處理，還是容易出現不純的菌落。若誘變劑產生的突變隻在 DNA雙鏈中的某一條單鏈，故該突變無法反映在當代的表型上。隻經過DNA的複製和細胞分裂，表型才會發生變異，出現不純菌落，這就叫表型延遲 (phenotypic lag) 。不純菌落的存在，也是誘變育種工作中初分離的菌株經傳代後很快出現生產性狀 “衰退”的主要原因。

（1）供試菌株的孢子或菌體的選擇

供試細胞要新培養的，細胞生理活性既要同步，又要在最旺盛的對數期，這樣突變率高，重現性也好。對細菌來說，常常通過前培養達到要求。菌懸液中的菌體應該是單細胞或單核的孢子，不但能均勻地接觸誘變劑，還可減少分離現象發生。在實際工作中，要得到均勻分散的細胞懸液，通常可用無菌的玻璃珠來打散成團的細胞，然後再用脫脂棉或濾紙過濾。

菌懸液的細胞濃度一般控製為：真菌孢子或酵母細胞 10 ⁶ ~ 10 ⁷ 個/ml，放線菌或細菌10 ⁸ 個/ml。菌懸液一般用生理鹽水（0.85%NaCl）稀釋。有時，也需用0.1mol/L磷酸緩衝液稀釋，因為有些化學誘變劑處理時，常會改變反應液的pH值。 

（2）菌懸液製備方法

細菌：在誘變處理前進行搖瓶振蕩培養，利用溫度和碳源控製其同步生長，離心洗滌，用冷生理鹽水或緩衝液製備菌懸液，放在有玻璃珠的三角瓶內振蕩10min，用無菌脫脂棉或濾紙過濾，通過菌體計數，調整菌懸液的濃度。孢子：在試驗中盡量采用成熟而成熟的孢子，並置於液體培養基中振蕩培養到孢子剛萌發，即芽長相當孢子直徑0.5－1倍。離心洗滌，加入生理鹽水或緩衝液，振蕩打碎孢子團塊，以脫脂棉過濾，計數，調整菌體濃度供誘變處理。對不產孢的真菌，可直接采用年幼的菌絲體進行誘變處理。

 

4、誘變劑的種類和選擇

A、誘變劑種類的選擇

物理誘變劑包括：各種射線，如紫外線（焦耳）、X射線（庫侖/千克）、β射線、γ射線、α射線和超聲波等；化學誘變劑包括 甲基磺酸乙酯（EMS）、亞硝基胍、亞硝酸、氮芥等。

選擇誘變劑要根據誘變劑作用機製，結合菌種特性來考慮選擇哪種誘變劑 ，同時要考慮菌種特性和遺傳穩定性。同時還要參考出發菌株原有的誘變係譜來選擇誘變劑。對遺傳穩定的菌株，最好采用以前未使用過的、突變譜較寬的、誘變率高的強誘變劑進行複合處理，然後再采用一些作用較緩的誘變劑處理。對遺傳不穩定的菌株，首先進行自然分離，劃分菌落類型，從中選擇效價高的、性能好的一類菌落作為誘變處理的出發菌株。采用溫和誘變劑或對該類菌劑進行繼續處理，從中篩選突變體。並結合自然分離和環境條件的改變，使有效的菌落類型不斷增加，成為正常型菌落。在誘變之前還要考查出發菌株的誘變係譜，詳細分析，總結規律性，選擇一種最佳的誘變劑。

B、最適誘變劑量的選擇

誘變的最適劑量，應該使所希望得到的突變株在存活群體中占有最大比例，這樣可減少以後的篩選工作。

要確定一個合適的劑量，通常要經過多次試驗。就一般微生物而言，誘變頻率往往隨劑量的增高而增高，但達到一定劑量後，再提高劑量會使誘變頻率下降。根據對紫外線、x 射線及乙烯亞胺等誘變劑誘變效應的研究，發現正突變較多地出現在較低的劑量中。而負突變則較多地出現在高劑量中，同時還發現經多次誘變而提高產量的菌株中，高劑量更容易出現負突變。因此，在誘變育種工作中，目前較傾向於采用較低劑量。例如，過去在用紫外線作誘變劑時，常采用殺菌率為90—99.9%的劑量，而近年來則傾向於采用殺菌率為70%～75%，甚至更低(30%～70%)的劑量，特別是對於經多次誘變後的高產菌株更是如此。 

化學誘變劑主要是調節濃度、處理時間和處理條件（溫度、pH等）。物理誘變劑主要控製照射距離、時間和照射過程中的條件（氧、水等），以達到最佳的誘變效果。

 

5、誘變處理

A、不同誘變處理方法

（1）紫外線照射

由於紫外線不需要特殊貴重設備，隻要普通的滅菌紫外燈管即能做到，而且誘變效果也很顯著，因此被廣泛應用於工業育種。

紫外線誘變育種的原理是：紫外線是波長短於紫色可見光而又緊接紫色光的射線、波長範圍為136～300nm，紫外線波長範圍雖寬，但有效範圍僅限於一個小區域，多種微生物最敏感的波長集中在265nm處，對應於功率為15W的紫外燈。它是一種非電離輻射，當物質吸收一定能量的紫外線後，它的某些電子將被提升到較高的能量水平，從而引起分子激發而造成突變；而不吸收紫外線的物質，能量不發生轉移，分子也不會激發，不會產生任何化學變化，然而，脫氧核糖核酸能大量吸收紫外線，因此它極容易受紫外線的影響而變化。紫外線的誘變作用是由於它引起DNA分子結構變化而造成的。這種變化包括DNA鏈的斷裂，DNA分子內和分子間的交連，核酸與蛋白質的交聯，嘧啶水合物和嘧啶二聚體的產生等，特別是嘧啶二聚體的產生對於DNA的變化起主要作用。  

紫外線誘變方法：將10mL菌懸液放在直徑為9cm的培養皿中，液層厚度約為2mm，啟動磁力攪拌器，使用15w功率紫外燈管，照射距離為30cm左右，照射時間以幾秒至數十分鍾為宜，具芽孢的菌株需處理10 min左右。為準確起見，照射前紫外燈應先預熱20~30min，然後再進行處理。

不同的微生物對於紫外線的敏感程度不一樣，因此不同的微生物對於誘變所需要的劑量也不同。在紫外燈的功率、照射距離已定的情況下，決定照射劑量的隻有照射時間，這樣可以設計一個照射不同時間梯度的實驗，根據不同時間照射的死亡率，作出照射時間與死亡率的曲線，這樣就可以選擇適當的照射劑量。

 

一般以照射後微生物的致死率在90%~99.9% 的劑量為最佳照射劑量，近來也有傾向於采用殺菌率70%~75%甚至更低(30%~70%)的劑量。一般認為，偏低的劑量處理後正突變率較高，而用較高的劑量時則負突變率較高，但高劑量造成損傷大、回複少。目前趨向采用低劑量、長時間處理，盡管致死率較高，而誘變效果較好。

實驗時，為了避免光複活現象，處理過程應在暗室的紅光下操作，處理完畢後，將盛菌懸液的器皿用黑布包起來培養，然後再進行分離篩選。

 

（2）CO60 照射

CO60屬γ射線，是一種高能電磁波，其誘發的突變率和射線劑量直接有關，而與時間長短無關。它能產生電離作用，直接和間接改變DNA結構。直接的效應是導致堿基的化學鍵、脫氧核糖的化學鍵、糖-磷酸相連接的化學鍵的斷裂；間接的效應是電離輻射使水和有機分子產生自由基，自由基作用於DNA分子，特別是對嘧啶的作用更強，可引起缺失和損傷，造成基因突變，還能引起染色體斷裂，引起倒位、缺失和易位等畸變。不同的微生物對C060的輻射敏感程度差異很大，可以相差幾倍，引起最高變異的劑量也隨菌種而有所不同。

一般照射時多采用菌懸液，也可用長了菌落的平皿直接照射。照射劑量在4~10萬倫琴，或者采用能使微生物產生90％~99％死亡率的劑量。電離幅射是造成染色體巨大損傷的最好誘變劑，它能造成不可回複的缺失突變，但可能影響鄰近基因的性能。

 

（3）等離子輸入

等離子輸入是一種較新的誘變方法，國外自20世紀60年代中、後期相繼開始把等離子注入技術應用於生物學領域的研究，國內將離子束作為一種新技術應用於生物等品種改良的研究則是由中國科學院等離子體物理研究所於1986年開創的。低能離子束是以具質量、能量雙重誘變效應的特征不同於傳統的電磁輻射，它的注入引發的生物效應，機製相當複雜，既有能量的沉積、動量的傳遞，又有粒子的注入和電荷的交換，可導致細胞表麵被刻蝕，引起細胞膜透性和膜電場的改良，與γ射線，中子束等明顯不同。離子束與生物體作用，首先有能量的沉積，即注入離子與生物大分子發生一係列碰撞，生物大分子獲得能量時，鍵斷裂，分子擊出原位，留下斷鍵或缺陷；同時還有質量沉積，離子束是高LET粒子，有Braag峰，具有較強的電離作用，還能產生活性高的自由基間接損傷作用，因此它對生物體的作用可導致較高的突變率；另外由於注入離子的不同電荷數、質量數、能量、劑量的組合，提供了眾多的誘變條件，通過這種電、能、質的聯合作用，將強烈影響生物細胞的生理生化特性，以引起基因突變，所以變異幅度大，有較高的突變率，較廣的突變譜；再者突變體的遺傳性能比較穩定，回複突變率低。

 

B、不同誘變處理方式

①單一因子處理：采用單一誘變劑處理，可以減少減少菌種遺傳背景複雜化、菌落類型分化過多的弊病，使篩選工作趨向簡單化。

②複合因子處理：指兩種以上誘變因子共同誘發菌體突變。適合於遺傳性穩定的純種及生活能力強的菌株處理，能導致較大的突變。主要有：兩個以上因子同時處理；不同誘變劑交替處理；同一種誘變劑連續重複使用；紫外線複活交替處理。