二、主要的基因型說明
1、基因重組相關的基因型
recA (Recombination)
功能:recA基因表達 ATP依賴型 DNA重組酶,它在λ-噬菌體與基因組 DNA的溶原重組時起作用,同時具有對 DNA放射性損傷的修複功能。由 recA基因的變異所產生的基因型使同源或異源 DNA的重組不能進行,保持插入 DNA的穩定性,對 DNA的轉化有利。一個菌株的基因型如果是 recA,則說明此菌株的表現型是重組缺陷的。
recB (Recombination)
功能:recB基因表達 ATP依賴型 DNase和核酸外切酶V的一個亞基,對recA的DNA重組酶起輔助和促進作用。DNase催化雙鏈DNA的解旋和解鏈,核酸外切酶V催化單鏈DNA的裂解,在DNA的重組和損傷修複中發揮重要作用。recB基因的變異導致其DNA重組和修複功能喪失,保證了外源DNA的穩定,有利於DNA轉化。
recC (Recombination)
功能:recC基因表達四種酶,即核酸外切酶V,ATP依賴型的核酸內切酶,解旋酶及ATP酶,它們和recA, recB所表達的酶相互協調作用,在DNA的重組及放射性損傷的修複中發揮作用。recC基因的變異導致DNA重組功能缺失,保證外源DNA的穩定性。
2、甲基化相關的基因型
dam (DNA adenine methylase)
功能:dam基因表達DNA腺嘌呤甲基化酶,它能催化特異序列GATC中A的甲基化,保證DNA免受限製性核酸內切酶Mbo I的切斷,同時在 DNA複製時也起一定的輔助作用。dam基因的變異導致腺嘌呤(A)甲基化酶活性的缺失,使腺嘌呤(A)不被甲基化,易於獲得非甲基化質粒。
dcm (DNA cytosine methylase)
功能:dcm基因表達DNA胞嘧啶甲基化酶,它能特異性識別DNA雙鏈上的CCWGG序列,並使第二個C甲基化,即CmCWGG,避免 DNA受到相關限製酶的切斷。dcm基因的導致胞嘧啶甲基化酶活性缺失,使外源DNA上的C不被甲基化,易於獲得非甲基化質粒。
mcrA (Modified cytosine restriction protein a)
功能:mcrA基因表達大腸杆菌防禦體係中起重要作用的mcrA酶,這種酶能特異性地作用於外來DNA上的被甲基化的胞嘧啶序列,即 C5mCGG特異序列,使之分解,對大腸杆菌本身起保護作用。mcrA基因的變異,導致上述功能缺失,對外來DNA中被甲基化的胞嘧啶特異序(C5mCGG)失去作用,有利於限製酶及甲基化酶的克隆體的穩定。
mcrB, C (Methyl cytosine-specific restriction)
功能:mcrB, C基因表達兩種特異性蛋白,即mcrB蛋白和 mcrC蛋白,它們在大腸杆菌的防禦係統中起重要作用。一般情況下,隻有這兩種蛋白同時存在時才表現出活性, mcrC具有識別和調節功能,它能特異性的結合到外源 DNA上被甲基化的胞嘧啶(C)的特異序列 G5mC上,然後由 mcrB蛋白切斷(mcrB蛋白是特異性切斷外來 DNA中 G5mC序列的限製性核酸內切酶),防禦外來 DNA的侵入。mcrB, C基因的變異,使上述的對外來 DNA的防禦作用缺失,對質粒的轉化有利。
mrr (Methylation requiring restriction)
功能:mrr基因是大腸杆菌細胞防禦係統中重要的基因之一,它能嚴格限製被甲基化的外源DNA的介入。另外,它對限製酶AccⅠ,CviR Ⅰ,Hinf IⅠ(Hha Ⅱ),Nla Ⅱ,Pst Ⅰ以及 N6-腺嘌呤甲基化酶和C5-胞嘧啶甲基化酶活性有明顯的抑製作用。mrr欠損株(基因型)可用於含有N6-mA和C5-mC的DNA的轉化。另外,含有此基因型的菌株也可用於限製酶和甲基化酶的克隆體。
hsdM (Host specificitive defective)
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功能:hsdM基因所表達的DNA甲基化酶是 I型限製酶複合體(具有對 DNA切斷和修補的雙重功能)的一部分,它能使DNA雙鏈上的AA (雙腺嘌呤) 甲基化,保護宿主DNA不被分解。hsdM的變異使細胞內的DNA不被甲基化,易於獲得非甲基化質粒。
3、點突變相關的基因型
mutS (Mutator)
功能:mutS基因表達的蛋白具有識別DNA上錯配序列的功能,並能修複其錯配序列(GC→AT),防止基因突變。mutS基因的變異導致DNA的錯配序列不能得到修複,容易發生基因突變,這對於利用點突變進行基因改造是有利的。
mutT(Mutator)
功能:野生大腸杆菌在進行DNA複製時,細胞中的8-OXO-dGTP插入模板DNA中的DA位點的效率幾乎與插入DC位點的效率相同,導致 A-T轉換成 G-C,使DNA產生變異。而mutT蛋白就是特異性地降解8-OXO-dGTP成為單磷酸鹽(8-OXO-dGMP),這種單磷酸鹽狀態的G(鳥嘌呤) 不能作為底物進行 DNA合成,從而防止了上述的基因突變。 mutT基因的變異使細胞中8-OXO-dGTP濃度增高,A→C的突變幾率增大,有利於利用點突變進行基因改造。
dut (dUTPase)
功能:dut基因表達脫氧尿嘧啶三磷酸核苷酸水解酶(dUTPase),它能水解dUTP成為dUMP,使細胞體內dUTP的濃度維持在較低的水平,尿嘧啶(U)就不易摻入到DNA中,避免了基因發生 A→U的突變。dut基因發生突變使dUTPase活性缺失,導致dUTP濃度升高,堿基U(尿嘧啶)極易摻入到DNA中,使其發生A→U的基因突變,有利於利用點突變進行基因改造。
ung (Uracil DNA glycosylase)
功能:ung基因表達尿嘧啶 -N-糖苷酶,這種酶能特異性識別DNA單鏈或雙鏈上發生突變的尿嘧啶殘基,並從DNA上水解去除尿嘧啶殘基,防止 DNA發生突變。ung基因的變異導致上述功能缺失,有利用點突變。
uvrB (Ultraviolet)
功能:uvrB基因表達核酸外切酶中的b亞基,這種核酸外切酶具有DNA的切補功能,對紫外線損傷的DNA有修補作用。uvrB基因的變異使細胞中核酸外切酶切除變異堿基的活性缺失,有利於點突變。
4、核酸內切酶相關的基因型
hsdR (Host specificity defective)
功能:hsdR基因表達 I型限製酶EcoK (K12株) 或 EcoB (B株),在大腸杆菌細胞中起到一種”抗體“的作用,對外來的各種 DNA有嚴格的限製。HsdR基因的變異導致菌株細胞內的 I型限製酶 EcoK或 EcoB活性缺失,這對於外來基因的導入及質粒轉化是有利的。
hsdS (Host specificitive defective)
功能:hsdS所表達的特異性蛋白是 I型限製酶EcoK或EcoB複合體中的一部分,它專門負責hsdR酶和hsdM酶對DNA序列的特異識別。hsdS基因的變異使hsdR和hsdM不能正確識別其作用的特異DNA序列,可以保持插入DNA的穩定性。
endA (Endonuclease)
功能:endA基因表達非特異性核酸內切酶Ⅰ,它能使所有DNA雙鏈解開,在DNA的複製和重組中起重要作用。endA基因的變異將使插入的外源 DNA更加穩定,提取的質粒純度更高。
5、停止密碼子相關的基因型
supE (Suppressor)
功能:supE基因表達的阻遏蛋白與停止密碼子UAG結合,使蛋白質合成停止。supE基因發生變異時,不能表達正常的阻遏蛋白,即使遇到停止密碼子 UAG,蛋白質合成仍能繼續,並使 UAG作為一個密碼子來編碼穀氨酰胺(Glutamine),從而使發生了琥珀突變(AAG→UAG)的基因對蛋白質表達得以延續,因此稱 supE為琥珀突變抑製因子。
supF (Suppressor)
功能:supF基因表達的阻遏蛋白與停止密碼子UAG結合,使蛋白質合成停止。supF基因變異時,不能表達正常的阻遏蛋白,即使遇到停止密碼子 UAG,蛋白質合成仍能繼續,並使 UAG作為一個密碼子編碼酪氨酸 (Tyrosine)。
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