微生物菌種資源複核技術規程

      微生物菌種資源的質量控製，包括菌種的存活性、純度、穩定性和鑒定結果正確性的核查檢測，是保存和利用微生物菌種資源的基礎。微生物菌種資源種類繁多，需要針對不同的微生物類群建立高效、自動化的形態學、生物化學及分子水平的標準化複核技術體係，在接收和保存菌種的過程中，對其進行必要的證實和檢查，及時了解菌株實際狀況，為生產和科研提供正確、標準的菌種資源。隨著人們對微生物認識的逐步深入，新的、能更好地反映不同微生物類群間自然進化親緣關係的分類係統不斷地取代舊的、人為的分類係統。通過菌種複核，可以及時反映學科的發展變化。

      微生物菌種資源的複核是針對那些被正式收錄和保藏的菌株所進行的核查。在保證菌株的存活性及純度的基礎上，微生物菌種的複核側重於對菌種鑒定結果的正確性進行驗證性檢查。微生物菌種複核檢測不同於微生物菌種的鑒定。

    本規程針對古菌、細菌、酵母菌、絲狀真菌，分別規定了複核的基本內容。

 

 

1    範圍

本規程規定了古菌、細菌、酵母菌、絲狀真菌等微生物菌種在保藏過程中，為保證菌種質量,對各類微生物菌種的存活性、純度、穩定性的檢測，對菌種鑒定結果正確性的複核鑒定，還包括當分類學體係發生變化時所應采取的相應措施。不包括病毒和寄生的微生物。

2    規範性引用文件

下列文件中的條款通過本規程的引用而成為本規程的條款。凡是注明日期的引用文件，其隨後所有的修改單（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用於本規程。然而，鼓勵根據本規程達成協議的各方，研究是否可以使用這些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本適用於本規程。

平台標準：細菌菌種資源描述規範（試行）。

平台標準：古菌菌種資源描述規範（試行

平台標準：酵母菌菌種資源描述規範（試行）。

平台標準：微生物菌種純度檢測技術規程  （試行）。

平台標準：微生物菌種資源共性描述規範（試行）。

平台標準：微生物生物危害分級分類規範（試行）。

平台標準：微生物資源分類編碼體係（試行）。

3           術語和定義

本規程采用下列術語和定義。

3.1複核  check

對保藏的各類微生物菌種，在接收和保藏過程中，為保證菌種質量而對鑒定結果進行的核查。包括對菌種活性、純度、穩定性等的檢測，以及采用最新分類學觀點對分類地位發生變化的菌種的重新鑒定。

3.2純培養  pure  culture

由單個細胞的後代組成的培養物，即單細胞培養物或無性繁殖係。通常是由挑取單個菌落或利用單孢分離技術，移種繁殖獲得。

3.3穩定性  stability

菌株的形態、致病性、生化特性、生產性能等特性經保藏後與保藏前的一致性。

3.4古菌  Archaea

Woese 1990 根據核糖體小亞基  rRNA  基因序列分析，構建了泛生命進化樹，提出生命的三域學說。該學說將地球生命劃分為細菌、古菌和真核生物三域。古菌是一群具有獨特的基因結構或係統發育生物大分子序列的單細胞生物，通常生活在地球上極端的生境或生命出現初期的自然環境中，如超高溫、高酸堿度、高鹽及無氧環境，營自養和異養生活。古菌在細胞大小，結構及基因組結構方麵與細菌相似，但其在遺傳信息的傳遞方麵更類似於真核生物。古菌中主要包括產甲烷菌、極端嗜鹽菌、無細胞壁的和極端嗜熱並代謝硫菌。

3.5細菌  bacterium，複數 bacteria

規範采用廣義的細菌概念，指 Woese 1990  泛生命樹所界定的細菌域中的所有分類群。細菌是一類種類繁多，無處不在的單細胞原核生物。其基本形態為球狀、杆狀和螺旋狀，有些放線菌則形成菌絲體，菌體寬度一般為  0.5-2  微米。大多數細菌具有含肽聚糖的細胞壁。細菌通常是以二分裂法進行增殖，間或出現一些不等分裂和出芽的種類。有一部分細菌還形成芽孢。細菌的遺傳結構可通過突變、接合、轉導或轉化發生改變。其營養要求各不相同，代謝方式也各具其特征。

3.6酵母菌  yeast

指那些主要以芽殖或裂殖方式進行無性繁殖的真菌，其營養階段主要以單細胞狀態存在，有性階段不形成子實體。

3.7絲狀真菌  filamentous fungi

在本規範中指除酵母菌外所有可培養的真菌。包括：接合菌、子囊菌、擔子菌、無性型真菌及卵菌中可培養的類群。

3.8分類單元（也稱分類群，Taxon,  複數 Taxa）

分類單元不是指分類係統中的一個"類目"，而是可以用來指任何等級的分類群。

4複核菌株的基本信息

複核菌株的基本信息為必備要素。(M)

複核記錄應標明所複核菌株的以下基本信息：保藏中心名稱、保藏方式、菌株保藏編號、菌株名稱（原定名）、複核日期、複核內容及結果（所進行的實驗項目及各項實驗結果）、複核結論、複核人員姓名、中心負責人簽字以及需要補充說明的有關內容。

5.存活性檢測  (M)

存活性檢測是所有微生物菌株複核的必備要素。

該項檢測應將采用不同保藏方法保存的培養物接種於適當的培養基，在合適的條件下培養，檢查其保藏後的生長情況，確定適用的長期保藏技術方法。

6. 純度檢測  (M)

純度檢測是所有微生物菌種複核的必備要素。

規定以下兩種檢測方法同時進行。

a.顯微鏡觀察，全部的細胞個體形態相似，染色反應一致。（或與原純菌的描述一致）

b.將培養物製成懸液，重新傾注平板，或平板劃線培養後，所形成的全部菌落形態一致或相似。

具體方法參照平台標準《微生物菌種純度檢測技術規程》

7. 複核鑒定

7.1古菌的複核鑒定

古菌菌種的複核鑒定應根據不同類群的主要特征，選擇最能反映該類群有別於其他分類群的特征來進行。包括：細胞形態、營養類型、氧的需求、以及對溫度、酸、堿、鹽的需求和耐受性等理化特性試驗、細胞膜脂成分分析等。

序列測定為複核的非必備要素。當需要複核的菌種缺少序列測定數據時，應將 16SrDNA 序列測定作為複核鑒定的內容之一。

7.2細菌的複核鑒定

針對具體類群，從以下幾個方麵選擇有代表性、鑒別性的特征特性進行複核鑒定。

l       顯微形態觀察：如細胞形狀、鞭毛、芽孢以及放線菌的菌絲、孢子絲和孢子的觀察；革蘭氏染色和抗酸染色反應等。

l       培養特性：水溶性色素和非水溶性色素的觀察，其它特定培養特征的觀察。

l       細胞化學組分分析：對於放線菌和部分高 G+C mol%  革蘭氏陽性細菌應對細胞壁化學組分進行必要的分析，包括細胞壁二氨基酸分析和糖型分析。

   序列測定為複核的非必備要素。當需要複核的菌種缺少序列測定數據時，應將 16S rDNA 序列測定作為複核鑒定的內容之一。

7.3酵母菌的複核鑒定

對於多數常用或常見的酵母菌，可依據表型信息對鑒定結果的正確性進行核查。

培養特性：菌落質地、顏色、高度、生長速度，對溫度的適應範圍等。

顯微形態觀察：如細胞大小和形態、無性繁殖方式、假菌絲形成與否；有性生殖方式、子囊孢子或擔孢子的形態特征。

生理生化特征：可采用基於數值分類鑒定原理的微量多項試驗鑒定係統，或通過手工配製生理生化特性鑒定培養基，檢測菌種的理化特性。

序列測定為複核的非必備要素。當需複核的菌種缺少序列測定數據時，應將測定26SrDNA  D1/D2和ITS  區的堿基序列作為複核鑒定的內容之一。

7.4絲狀真菌的複核鑒定

絲狀真菌的複核鑒定主要依據不同分類群的培養特征和顯微形態特征。

7.4.1接合菌菌種的複核鑒定

接合菌菌種的複核鑒定主要根據以下所列接合菌的分類依據進行。

培養特性：菌落（菌叢）質地、顏色、生長速度、氣生菌絲高度，對溫度的適應範圍，  尤其是最高和最低生長溫度。

營養體細胞的構造：菌絲隔膜產生情況，假根的有無，發達程度及其著生方式。

無性繁殖特征：孢囊梗長短、簇生或單生，不分枝或分枝，分枝的類型，直立或彎曲；孢囊形狀、大小，內含孢囊孢子的數量，囊壁消解與否；囊軸形狀、大小，  顏色；囊托的有無、形狀、大小；孢囊孢子形狀、大小、表麵紋飾、附屬絲的有無；厚垣孢子的有無。

有性生殖特征：接合孢子是同宗還是異宗配合，配囊柄對生或並生，配囊柄形狀、大小。

7.4.2子囊菌菌種的複核鑒定

主要指那些可培養，並在培養過程中容易產生有性型的子囊菌類群。如：紅曲屬（Monascus）、 脈孢菌屬(Neurospora)、毛殼菌屬（Chaetomium）等。這些類群的複核鑒定應主要依據以下形態特征。

菌落形態特征：菌落質地、生長速度、菌絲體顏色、色素的產生情況、菌落反麵的顏色等。

體細胞的構造：菌絲分隔、分枝情況，菌絲內含物的有無等。

無性繁殖特征：分生孢子梗、產孢細胞、分生孢子的形態特征（大小、顏色，著生方式）。

有性生殖特征：閉囊殼或子囊殼的形態特征（大小、顏色，表麵附屬物的形態特征）；子囊的形態特征及其結構（排列方式，形態、大小，成熟後其壁的消解情況）；子囊孢子的形態特征（顏色、形態、大小、表麵紋飾）

7.4.3擔子菌菌種的複核鑒定

由於這類菌有其特有的栽培特性和直接的商品生產價值，對這類菌的複核，除培養特征外，還應對其農藝性狀和商品性狀進行檢驗。具體包括以下內容：

培養特征：菌落生長速度、子實體發育動態。

體細胞的構造：有無鎖狀聯合、菌絲體類型。

成熟子實體的形態特征：菌蓋、菌柄、菌環、菌托、菌褶和菌管、菌肉（菌髓）。

有性生殖體形態特征：擔子的類型、擔孢子形態、顏色、大小及表麵紋飾。

7.4.4無性型真菌分類群的複核鑒定

指那些在培養過程中一般不產生有性型以及尚未發現其相應的有性型的絲狀真菌。如：青黴屬（Penicillium）、  曲黴屬（Aspergillus）、  木黴屬（Trichoderma）等。對這些類群的複核鑒定主要包括對其菌落形態特征及顯微特征的觀察和比較。

菌落形態特征：菌落質地、顏色、生長速度，色素的產生情況、滲出液、氣味的有無，菌落反麵的顏色等。

菌體形態特征：菌絲分隔、分枝情況，菌絲內含物的有無等（主要指無孢菌群）

無性繁殖體形態特征：分生孢子梗發生部位、分枝情況；分生孢子頭的形狀；分生孢子產生方式、形狀、大小、顏色、表麵情況（光滑或具不同的紋飾）；

厚垣孢子的有無及其形狀、大小、顏色。以及是否產生特殊的分生孢子結構，如：孢梗束、分生孢子座等。

7.4.5卵菌菌種的複核鑒定

卵菌各分類群的複核鑒定主要依據以下形態特征。

培養特征：在固體培養基上菌落形態，對溫度的適應範圍，最適生長溫度。

體細胞的構造：菌絲體發達與否、分枝情況、菌絲寬度、孢囊梗與菌絲有無明顯區別等。

無性繁殖體形態特征：孢子囊形態、孢子囊萌發時是否產生泡囊；孢囊梗形狀與分枝情況；遊動孢子形成方式、形態，是否具兩遊現象；厚垣孢子的有無。