微生物菌種資源種類繁多，需要針對不同的微生物類群建立簡便有效的形態學、生物化學等標準化的純度檢測技術。微生物菌種純度檢測是微生物菌種進行鑒定、保存、評價和利用的前提條件，是確保鑒定結果的準確性和資源保藏質量的基本保障。
製定本規程的目的是為健全質量保證管理體係，保證微生物菌種資源的質量，規範各類微生物菌種資源純度檢測。
微生物菌種純度檢測技術規程
1 範圍
本規程規定了古菌、細菌、真菌、病毒（種）純度檢測的程序和方法。
本規程適用於從事微生物菌種資源保藏及研究的機構、大學、企業、個人等。
2 術語、定義
下列術語和定義適用於本規程
2.1純度檢測 purity check
指通過適當的方法檢測菌種是否為純培養物。
2.2純培養 pure culture
由單個細胞的後代組成的培養物，即單細胞培養物或無性繁殖係。通常是由挑取單個菌落或利用單胞分離技術，移種繁殖獲得。
3. 菌種的純度檢測
3.1古菌和細菌的純度檢測
3.1.1菌落形態
在特定的培養基上，將待檢測培養物稀釋塗布或平板劃線，適宜培養後，同一平板上的單菌落的大小、形狀、顏色、質地、光澤等是否相似；對於兩種或以上形態的出發菌株，應再分別挑取單菌落劃線或稀釋塗布培養，檢測是否重複出現相同特征。
3.1.2細胞形態
對數生長期的培養物革蘭氏染色反應應呈現一致性；細胞形狀、大小、莢膜等特征應相似
3.1.3芽孢大小、位置、形狀
宜檢測樣品是否形成芽孢，對形成芽孢的菌種，其芽孢大小、位置、形狀應相似。
3.2放線菌菌種純度檢測
3.2.1菌落形態
在特定的培養基上，將待檢測培養物稀釋塗布或平板劃線,挑取單菌落，適宜培養後，在同一平板上單菌落形狀、大小、表麵狀況、質地、光澤、顏色等應相似。如懷疑為細菌汙染，則30℃液體培養24小時，培養液不應渾濁，如渾濁則視為細菌汙染。
3.2.2培養特征
分別接種三種以上培養基，在三種以上培養基上的培養特征應相同，包括氣生菌絲、基內菌絲、可溶性色素的顏色等。
3.2.3孢子絲及孢囊
在特定的培養基、培養溫度及培養時間等條件下，孢子著生方式、孢子絲形態及其顏色或孢囊著生位置（氣絲或基絲）、孢囊的形狀，大小應呈現出一致性。
3.3酵母菌種純度檢測
3.3.1菌落形態
應對菌落形態相似性進行檢測。在特定的培養基上，通過對待檢測菌株進行稀釋或劃線塗布平板獲取單菌落，一定的培養條件下，比較同一平板內，菌落的大小、形狀、顏色、隆起、表麵狀況、質地、光澤等應一致。
3.3.2個體形態
應對檢測樣品的個體形態進行檢測。在指定的培養基及培養條件下，細胞形狀、大小及細胞的增殖方式應一致。
3.3.3繁殖方式
酵母繁殖的方式應一致，如是芽殖，出芽的方位、數量應一致。
3.4絲狀真菌菌種純度檢測
3.4.1菌落特征
菌落的形態等表觀特征應一致。
3.4.2菌絲特征
在特定的培養基和培養條件下，菌絲分隔、菌絲形態等應一致。
3.4.3其他主要顯微特征應一致
3.4.4檢測是否有細菌汙染
3.4.5對於外觀上不能確定菌種純度的，利用單胞分離技術獲得純培養物進行對比，其菌絲、孢子等特征應與原始菌株的描述一致。
3.5病毒的純度檢測
3.5.1純粹檢查
應將待檢病毒液直接接種含硫乙醇酸鹽培養基（T.G）、酪蛋白腖瓊脂培養基（G.A）、葡萄糖蛋白腖湯。通過一定溫度時間培養後，檢查結果應無細菌生長為純粹。
3.5.2支原體檢查
檢測由禽胚組織或其細胞所培養的病毒應用改良Frey氏培養基。檢測其它培養方法所得病毒應用支原體培養基。任何一次瓊脂平板上出現支原體菌落，判為陽性。陽性對照中至少有一個平板長菌落，而陰性對照中無菌落生長，則檢驗有效。
3.5.3外源病毒檢查
病毒類製品在毒種選育和生產過程中，經常使用動物或細胞基質培養，因此，有可能造成外源因子（特別是外源病毒因子）的汙染。為了保證製品質量，需要對毒種和細胞進行外源因子檢測。
3.5.3.1對病毒主種子批或工作種子批，應抽取足夠檢測試驗需要量的供試品進行病毒外源因子檢測。在試驗前應用特異性抗體（血清）中和本病毒（或單克隆抗體），所用的抗體免疫源應采用與生產疫苗（或製品）不同種而且無外源因子汙染的細胞（或動物）製品。如果病毒曾在禽類組織或細胞中繁殖過，則抗體不能用禽類來製備。若用雞胚，應來自 SPF 雞群。以下方法可以選擇一種或多種進行。
3.5.3.1.1動物試驗法
3.5.3.1.1.1小鼠試驗法
取 15－20g 小鼠至少 10 隻，用經抗血清中和後的病毒懸液，每隻腦內接種 0.03ml，同時腹腔接種 0.5ml。至少觀察 21 天。在觀察期內至少有 80％最初接種的小鼠存活，試驗才有效。如果沒有小鼠出現病毒感染，為符合要求。解剖所用在試驗 24 小時後死亡或有患病體征的小鼠，直接觀察期病理改變，並將有病變的相應的組織懸液通過腦內和顱腔接種另外至少 5 隻 15－20g 小鼠，並觀察 21 天，如果沒有小鼠出現病毒感染，則符合要求。
3.5.3.1.1.2乳鼠試驗法
取出生後 24 小時內的乳鼠至少 10 隻，用經抗血清中和後的病毒懸液，腦內接種0.01ml，同時腹腔接種至少 0.1ml。每天觀察，至少 14 天。在觀察內至少有 80％最初接種的乳鼠存活，試驗才有效。如果沒有小鼠出現病毒感染，為符合要求。解剖所有在試驗 24 小時後死亡或有患病體征的乳鼠，直接肉眼觀察其病理改變，並取有病變的相應的組織和腦、脾製備成懸液通過腦內和腹腔接種另外至少 5 隻出生後 24 小時內乳鼠，並每天觀察至接種第 14 天，如果沒有小鼠出現病毒感染，則符合要求。
3.5.3.1.2細胞培養法
3.5.3.1.2.1非血吸附檢查
用經抗血清中和後的病毒懸液，接種於生產用的同種的細胞。細胞至少接種 6 瓶，每瓶病毒懸液接種量不少於培養液總量的 25％。於 36±1℃培養，觀察 14 天，必要時可更換細胞培養液，未見細胞病變（CPE）為陰性，符合要求。
3.5.3.1.2.2血吸附病毒檢查
上述接種病毒的各個細胞於第 6－8 天後和第 14 天，取出 2 瓶進行血吸附病毒檢查。用 0.2％－0.5%雞和豚鼠紅細胞混合菌懸液覆蓋於細胞表麵，分別置於 2－8℃，20－25℃，30 分鍾後顯微鏡下觀察，未見血球吸附現象為陰性，符合要求。
3.5.3.1.3雞胚檢查法
在禽類組織或細胞中繁殖過的病毒種子需用雞胚檢查禽類病毒的汙染。選用 9－11日和 5－7 日齡兩組 SPF 雞胚，每組至少 5 隻，分別於尿囊腔和卵黃囊接種經抗體血清中和後的病毒懸液，每胚 0.5ml。孵育 7 日後，取尿囊液用豚鼠和雞血細胞混合懸液做血球凝集試驗應為陰性。被接種的雞胚至少 80％存活 7 天，試驗有效。
3.5.3.2生產用細胞外源因子檢查
3.5.3.2.1細胞直接觀察
每批生產用細胞應留取 5％（或不少於 500ml）,細胞懸液不接種病毒，作為對照細胞加入與疫苗生產相同的細胞維持液，置於與疫苗生產相同的條件下培養，觀察 14天，在顯微鏡下觀察是否有細胞病變（CPE）出現，無細胞病變（CPE）出現者為陰性，符合要求。在觀察期末至少有 80％的對照細胞培養物存活，試驗有效。
3.5.3.2.2血清吸附病毒檢查
對生產用細胞外源因子檢查的（1）項細胞培養物在觀察期末取至少 25％的細胞培養瓶進行血吸附病毒檢查。（方法同病毒種子批外源因子檢查的血吸附病毒檢查）
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