微生物培養基質控與圖解——細菌的生長與培養基

第二節  細菌的生長與培養基

培養基(Culture Medium)是微生物生長、分離鑒別的營養基礎。培養基是醫學衛生研究、醫藥工業生產、臨床細菌檢驗、流行病學調查及生物製品製造等行業的基礎。培養基在微生物領域中發揮著重要的作用。

    目前，除麻風杆菌、梅素螺旋體等少數菌種外，絕大多數細菌都可以在人工培養基上生長，細菌培養必須滿足不同細菌的生長條件。

一、細菌生長的一般條件

    細菌生長繁殖的必要條件是：

    1.充足的營養。這是細菌生長繁殖所需的原料和能量的來源。

    2．適宜的酸堿度。pH7.2~7.6條件下，多數細菌體內酶的活性最強，有利於新陳代謝；少數菌必須在偏酸或偏堿的條件下生長，如結核杆菌為pH6.4~7.0，乳酸杆菌為pH5.5，霍亂弧菌在pH8.8時生長最好。

    3．合適的溫度。通常37℃適合病原菌生長，但各類細菌對溫度的要求差異較大，如鼠疫杆菌和小腸結腸耶爾森菌是28℃，空腸彎曲菌是42℃。

    4．必要的氣體環境。根據細菌對氧需求的不同可將細菌分成四類：

    (1)專性需氧菌(obligate aerobe)。此類細菌具有完善的呼吸酶係統，需要分子氧作為受氫體完成有氧呼吸，在無遊離氧的環境中不能生長。如結核杆菌、霍亂弧菌等均屬此類。

    (2)微需氧菌(microaerophilic bacterium)。此類細菌在低氧壓下(5%~10%)生長最好，當氧壓超過10%時對其有抑製作用。如空腸彎曲菌、幽門螺杆菌等。

    (3)兼性厭氧菌(facultative  anaerobe)。兼有有氧呼吸和無氧酵解兩種功能，不論在有氧或無氧環境都能生長，但以有氧時生長較好。大多數病原菌屬此類。

    (4)專性厭氧菌（obligate anaerobe）。此類細菌缺乏完善的呼吸係統，隻能在無氧環境中進行酵解。在有遊離氧條件下，不能利用分子氧，而且還遭受分子氧的毒害，甚至死亡。如破傷風杆菌、脆弱擬杆菌等屬此類。

二、培養基的分類

    （一）按培養基用途分

    1．營養培養基。含微生物生長繁殖所需基本營養物質的培養基常用以牛肉浸粉、蛋白腖、氯化鈉為基礎，也可增加所需的其他營養物質，如血液等。瓊脂是培養基中常用的凝固劑，以支撐細菌的生長形態形成菌落，它對細菌無營養價值。

  2．增菌運送培養基。將可疑標本接種於運送培養基中。增菌培養基為液體，是擴大培養的手段，也是細菌生化反應的主要培養方法。

  3．選擇鑒別培養基。在培養基中加入指示劑或化學物質，抑製某些細菌生長而有助於需要的細菌生長，或通過指示劑顏色變化分離鑒別細菌。

  4．特殊培養基。包括厭氧培養基及其他（抗生素效價測定和藥敏試驗）培養基。

    （二）按培養基物理性狀分

    1．液體培養基。將營養物質溶解於液體中，調整pH滅菌後即為液體培養基。常用於細菌增菌或觀察細菌的生化反應。

    2．固體培養基。液體培養基中加入13~15g/L瓊脂，溶化後凝固成固體培養基。製成平皿，用於分離培養、活菌計數、選擇培養、藥敏試驗。固體培養基可在試管中製成斜麵用於菌種傳代和短期保存。

    3．半固體培養基。液體培養基中加入2~5g／L瓊脂。用於細菌動力觀察和菌種保存

三、致病性細菌的特殊生長條件

    由於細菌種屬不同，營養需求不同，按細菌外形可分為球菌、杆菌和螺形菌。現將所需的培養條件簡述如下。

    1．球菌( coccus)

    呈圓球形、矛頭狀或腎形，單個球菌直徑約為0.5~3.0um。繁殖時按細菌排列方式不同可分雙球菌、鏈球菌、四聯球菌、八疊球菌和葡萄球菌。常見球菌包括葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌、腦膜炎球菌及淋球菌等。它們可引起人類化膿性感染，又稱為化膿性球菌。在血瓊脂平板上，金黃色葡萄球菌呈現透明溶血環。表皮葡萄球菌等在血平板上無溶血現象。鏈球菌需要在含血液或血清培養基上生長。根據菌落周圍溶血環特點分為三類：不溶血、形成完全透明溶血環（β溶血）和草綠色溶血環（α溶血）。肺炎鏈球菌在含血液培養基上生長，菌落周圍形成草綠色溶血環。奈瑟菌屬營養要求高，常用巧克力色血瓊脂平板分離培養，因通過血液加熱後可釋放出大量的x、v因子，供細菌生長需要。

  2.杆菌( bacillus)

多呈直杆狀，少有微微彎曲。杆菌的長短、粗細和彎度隨菌種不同而異。杆菌的直徑約為0.2 - 2um，長短0.5~20um不等。杆菌菌體兩端平齊，如炭疽杆菌。兩端呈尖狀如梭杆菌，其中艱難梭菌生長條件苛刻，需加血嚴格厭氧培養。也有一端膨大呈棒狀，如白喉杆菌在呂氏血清培養基上生長最快，形態最典型，呈白色，圓型凸起，光滑菌落。亞碲酸鉀血瓊脂上菌落呈黑色，常作為本菌的篩選鑒別。這是因為亞碲酸鉀能進入白喉杆菌菌體被還原成黑色金屬碲。亞碲酸鉀可抑製雜菌生長，而白喉杆菌不受影響。菌體兩端呈分枝狀為分枝杆菌，如結核分枝杆菌專性需氧，最適pH6.4~7.0。營養要求高，生長緩慢。常用L-J (Lo-wenstein - Jensen)培養基，內含蛋黃、甘油、馬鈴薯、天門冬素、無機鹽和孔雀綠。孔雀綠為選擇性抑製劑，可阻止腐敗菌生長。培養時間需8天以上至8周。菌落特點為幹燥、粗糙、質硬、乳白色或乳酪色。

    腸杆菌屬是寄生在人或動物腸道中一大群革蘭陰性杆菌。多數有鞭毛，需氧或兼性厭氧。營養要求不高，能在普通培養基上生長。但腸杆菌屬生化反應活躍，能分解多種糖類、蛋白質形成不同的代謝產物。常見的有大腸埃希茵、沙門菌和誌賀菌，分解糖屬發酵反應。

    3．螺形菌

    螺菌( spiral bacterium)菌體彎曲。根據彎曲個數分為隻有一個彎曲的弧菌（vihrio）和數個彎曲的螺菌( spirillum)。弧菌屬中，霍亂弧菌營養要求不高，耐堿不耐酸，在pH8.8—9.0的堿性蛋白腖水或堿性瓊脂平板上生長良好。霍亂弧菌和擬態弧菌可在無鹽腖水中生長。副溶血性弧菌是一種嗜鹽弧菌，在含3%—4%NaCl培養基中生長良好。目前常用TCBS瓊脂培養基分離霍亂弧苗，該培養基含有硫代硫酸鹽、枸櫞酸鹽、膽鹽及蔗糖，可選擇性地抑製其他腸道菌屬，有利於弧菌生長。霍亂弧菌可分解蔗糖呈黃色菌落。副溶血性弧菌則呈藍綠色。

    彎曲菌是一類呈逗號或S形革蘭陰性菌。需要在加血培養基上生長，營養條件高，需含5%氧氣，10%二氧化碳，85%氮氣中培養。使人體致病的菌為空腸彎曲茼。最常見的螺杆菌是幽門螺杆菌( Hp)。37℃生長，營養要求高，培養基中需加血液、血清，常引起人胃及十二指腸潰瘍。

    細菌的大小、形態和細菌細胞排列是細菌的重要生理特征之一。一般而言，在適宜的生長條件下培養8～18小時，細菌的生理特征最為典型，宜選擇細菌的對數生長期觀察細菌形態和大小。

    通過標本的塗片及染色，能觀察細菌的形態、大小、排列、染色特性，以及莢膜、鞭毛、芽胞、異染顆粒等結構，有助於細菌的初步識別或診斷。

    對細菌進行染色檢查，應先製作細菌塗片。臨床標本可直接塗抹於潔淨的載玻片上；液體培養基中的細菌取培養液直接塗於載玻片上；對於固體培養基上的菌落，則需在載玻片進行固定，以殺死細菌，固定細胞質和結構，改變細菌對染色的通透性。一般用火焰固定，有時根據需要用冰凍幹燥法或化學方法，如醇、酸、氯化高汞等固定。