抑菌劑（防腐劑）效力檢查法係用於測定滅菌、非滅菌製劑中抑菌劑的活性，以評價最終產品的抑菌效力，同時也可用於指導生產企業在研發階段製劑中抑菌劑濃度的確定。

     如果藥物本身不具有充分的抗菌活性，那麽應根據製劑特性（如水溶液製劑）添加適宜的抑菌劑，以防止製劑在正常貯藏和使用過程中可能發生的微生物汙染和繁殖使藥物發生變質而對使用者造成危害，尤其是多劑址包裝的製劑。

      在藥品生產過程中，抑菌劑不能用於替代藥品生產的GMP管理，不能作為非滅菌製劑降低微生物汙染的唯一途徑，也不能作為控製多劑量包裝製劑滅菌前的生物負載的手段。

所有抑菌劑都具有一定的毒性，製劑中抑菌劑的量應為最低有效量。同時，為保證用藥安全，最終包裝容器中的抑菌劑有效濃度應低於對人體有害的濃度。

      在製劑通則中要求具有抗菌活性的製劑，不管是添加的抑菌劑，還是藥物本身具有抗菌活性，在藥物研發階段，均應確認其抗菌效力。抑菌劑的抗菌效力在貯存過程中有可能因藥物的成分或包裝容器等因素影響而提高或降低，因此，應驗證最終容器中的抑菌劑效力在有效期內不因貯藏條件而降低。

      本試驗方法和抑菌劑抑菌效力判斷標準用於包裝未啟開的成品製劑。

進行本試驗的藥品分為四類（表1 ) ，以便標準的製定和執行。

表l 產品分類

 

1.胰酪腖大豆肉湯培養基（TSB )

酪蛋白腖                         17.0g

磷酸二氫鉀                       2.5g

大豆木瓜蛋白酶消化物       3.0g

氯化鈉                            5.0g

葡萄糖                            2.5g

水                                  1000ml

      除葡萄糖外．取上述成分混合，微溫溶解，調pH 值約7.0 ，煮沸，加入葡萄糖溶解後，搖勻，濾清，調節pH 值使滅菌後為7.3 士0.2 ，分裝，滅菌。

2.胰酪腖大豆瓊脂培養基（TSA )

      除上述胰酪腖大豆肉湯培養基的處方和製法，加入14.0g瓊脂，調pH 值使滅菌後為7.3 士0.2 ，分裝，滅菌。

      照微生物限度檢查法（附錄XII G ）製備。

      抑菌劑效力測定用培養基應進行培養基的適用性檢查，包括成品培養基、由脫水培養基或按處方配製的培養基均應檢查。

菌種  
      試驗所用的菌株傳代次數不得超過5 代（從菌種保藏中心獲得的冷凍幹燥菌種為第0代），並 采用適宜的菌種保藏技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性。

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa ) [ CMCC ( B ) 10104]

大腸埃希菌（Escherichia coli ) [ CMCC ( B ) 44102 ]

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[ CMCC( B ) 26003 ]

白色念珠菌（Candida albicans）[ CMCC ( F ) 98001 ]

黑曲黴（Aspergillus niger ) [ CMCC ( F ) 98003 ]

      接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養物至胰酪腖大豆肉湯培養基中，30 ～35 ℃ 培養18～24 小時；接種白色念珠菌的新鮮培養物至沙氏葡萄糖液體培養基中，20 ～ 25 ℃ 培養24 ～48 小時。上述培養物用0.9 ％無菌氯化鈉溶液製成每lml 含菌數為50～100CFU 的菌懸掖。接種黑曲黴的新鮮培養物至沙氏葡萄糖瓊脂斜麵培養基中，20～25 ℃ 培養5 ～7 天，加入3 ～5ml 含0.05 % ( ml / ml ）聚山梨醋80 的0.9 ％無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然後，采用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內．用含0.05 ％（ml / ml ）聚山梨酯80的0.9 ％無菌氯化鈉溶液製成每1 ml 含孢子數50～100CFU 的孢子懸液。

      菌液製備後若在室溫下放置，應在2 小時內使用；若保存在2 ～8 ℃ ．可在24 小時內使用。黑曲黴～子懸液可保存在2 ～8 ℃。在驗證過的貯存期內使用。

      取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌各50 ～100CFU ，分別注入無菌平皿中，立即傾注胰酪腖大豆瓊脂培養基，每株試驗菌平行製備2 個平皿，混勻，凝固，置30～ 35 ℃ 培養48 小時，計數；取白色念珠菌、黑曲黴各50～100CFU ，分別注入無菌平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養基，每株試驗菌平行製備2 個平皿，混勻，凝固，置20 ～25 ℃ 培養72 小時，計數；同時，用對應的對照培養基替代被檢培養基進行上述試驗。

      若被檢培養基上的菌落平均數不小於對照培養基上菌落平均數的70 % ，且菌落形態大小與對照培養基上的菌落一致，判該培養基的適用性檢查符合規定。

       同培養基的適用性檢查，若需要，製劑中常見的汙染微生物也可作為試驗菌株。

      接種銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的新鮮培養物至胰酪腖大豆肉湯培養基或胰酪腖大豆瓊脂培養基中，30 ～35 ℃ 培養18 ～24 小時；接種白色念珠菌於沙氏葡萄糖液體培養基或沙氏葡萄糖瓊脂培養基中，20 ～25 ℃ 培養24～48 小時。若為瓊脂培養物，加入適量的0.9%無菌氯化鈉溶液將瓊脂表麵的培養物洗脫，然後，用適宜方法吸出菌懸液至無菌試管內，加人適量的0.9 ％無菌氯化鈉溶液並采用比濁法製成每lml 含菌數約為10⁸CFU 的菌懸液。若為液體培養物，用離心法收集菌體，並用0.9 ％無菌氯化鈉溶液衝洗，采用比濁法製成每lml 含菌數約為10⁸CFU 的菌懸液。接種黑曲黴的新鮮培養物至沙氏葡萄糖瓊脂培養墓中，23 ～28 ℃ 培養5 ～7 天，加入3 ～5ml 含0.05 % ( ml / ml ）聚山梨酯80 的0.9 ％無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，然後，用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內，加入適量的含0.05 % ( ml / ml ）聚山梨酯80的0.9 ％無菌氯化鈉溶液並采用比濁法製成每lml 含孢子數10⁸CFU 的孢子懸液。同時采用平皿法測定lml 菌懸液的菌數。

      菌液製備後若在室溫下放置，應在2 小時內使用；若保存在2 ～8 ℃ ，可在24 小時內使用。黑曲黴的孢子懸液可保存在2 ～ 8 ℃ ，在1 周內使用。

     抑菌劑效力可能受試驗用容器特征的影響，如容器的材質、形狀、體積及封口的方式等。因此，隻要供試品每個包裝容器的裝量足夠試驗用，同時容器便於按無菌操作技術接入試驗菌液、混合及取樣等，一般應將試驗菌直接接種於供試品原包裝容器中進行貯存。若因供試品的性狀或每個容器裝量等因素需將供試品轉移至無菌容器時，該容器的材質不得影響供試品的特性（如吸附作用），特別應注意不得影響供試品的pH , pH 對抑菌劑的活性影響很大，同時容器的口徑大小應便於供試品的進出及混勻。

      取包裝完整的供試品至少5 份，直接接種試驗菌，或取適量供試品分別轉移至5 個適宜的無菌容器中（若試驗菌株數超過5 株，應增加相應的供試品份數），每一容器接種一種試驗菌，1 、2 、3 類供試品中1g 或lml接種菌量為10⁵～ 10⁶ CFU , 4 類供試品中1g 或lml 接種菌最為l0³～10⁴CFU ，接種菌液的體積不得超過供試品體積的0.5 % ～1% ，充分混合，使供試品中的試驗菌均勻分布．然後將接種的供試品在試驗期間置20～ 25 ℃ ，避光貯存。貯存溫度的變化應盡可能控製在最小範圍，並防止被汙染，

       根據產品類型，在供試品剛接種（0 時）及表2 規定的間隔時間，分別從上述每個容器中取供試品lml ( g ) ，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液稀釋成1:10 、l:10² 、1:10³ 等稀釋級。采用平皿法或薄膜過濾法（照附錄XII G 微生物限度檢查法，其中測定細菌用胰酪陳大豆瓊脂培養基，測定真菌用沙氏葡萄糖瓊脂培養基）測定每份供試品中所含的菌數。菌數測定方法應進行驗證，驗證方法按微生物限度檢查法（附錄XII G ）中的“計數方法的驗證”進行，其中測定細菌用胰酪腖大豆瓊脂培養基，測定真菌用沙氏葡萄糖瓊脂培養基。

       根據菌數測定結果，計算lml ( g ）供試品各試驗菌所加的菌數及各間隔時間的菌數，並換算成1g 值。

      抑菌劑效力根據各間隔時間的菌數lg 值相對於初始值（0 時菌數lg值）減少程度進行評價（表2 ) ，試驗結果按有效數字的修約規則進舍，保留小數點後1 位有效數字。結果符合表2 要求可判定該產品抑菌效力符合規定。

表2 抑菌荊抑菌效力判斷標準

 

注：表中“不增加”是指對前一個測定時間，試驗菌增加的數量不超過0.5lg。