細菌檢驗工作的基本技術——鏈球菌屬

在鑒別上述菌屬時，關鍵是：①革蘭染色。上述菌屬的革蘭染色特性相似，若從瓊脂平板上塗片染色，無色藻菌屬中某些菌種的形態呈現球杆形、杆形，容易與乳杆菌屬菌種相混淆，後者觸酶亦陰性。若生長在鹽肉湯塗片，最容易出現不一致性。②觸酶試驗。目的是與葡萄球菌屬和口腔球菌屬鑒別。屬間鑒別參見下表。

表              觸酶陰性或弱陽性的革蘭陽性球菌的鑒別特征

注：a．S，敏感；R，耐藥；+，陽性反應；一，陰性反應；V，反應不定(有些菌株+，另外菌株-)

b．化膿鏈球菌和L-garviae可陽性。

c．偶爾例外。

鏈球菌屬內鑒別，首先觀察在血液瓊脂平板上的溶血環，是β溶血型，或非β溶血型，參照這二類溶血型菌種的鑒別。

1．β溶血鏈球菌的鑒定：β溶血型鏈球菌的鑒定都是檢測特異多糖抗原稱為鏈球菌群多糖抗原來分群，可采用商業性試劑盒，當前血清學診斷方法尚未普及之前，傳統的對β溶血鏈球菌的鑒別仍是需要的。

A、B、D、G群細菌，一般可用杆菌肽、CAMP、膽汁七葉苷及PYR、VP等試驗區別 (見表)。

表                      β溶血鏈球菌的鑒別特征

注：a．+，陽性；一，陰性；d，不同菌株。

  b．有人認為咽峽炎鏈球菌與米勒鏈球菌是同義詞。

 

2．非β溶血鏈球菌鑒別

肺炎鏈球菌的鑒定：生長在血瓊脂平板上的菌落細小，圓形，表麵光滑、灰白色、邊緣整齊，半透明，開始扁平以後中心塌陷，呈臍窩狀。菌體呈矛頭狀成雙排列。該菌對Optochin敏感和膽汁溶菌試驗陽性。

3．牛鏈球菌的鑒定：具有D群多糖抗原，6.5％NaCl不生長，PYR陰性，膽汁七葉苷陽性，與其他草綠色鏈球菌鑒別見下表。

表                     非β溶血型鏈球菌的鑒別

注：a. +，陽性反應；-，陰性反應；土，有些菌株陽性，另外菌株陰性。

b. 偶見例外。

 

營養變異鏈球菌是草綠色鏈球菌的營養變種，在普通肉湯或瓊脂平板上生長不良(通常發現在血液培養瓶中)。若培養基中加入吡哆醛或做“衛星現象”試驗容易被發現，有二個種，即缺陷鏈球菌S．defectivus，毗鄰鏈球菌S.adjacens。

草綠色鏈球菌的鑒定：革蘭陽性球菌，觸酶陰性，非β溶血、膽汁溶菌陰性，Optochin陰性，不存在B、D群抗原，6.5％NaCl肉湯不生長，PYR陰性，10℃，45℃不生長，膽汁七葉苷陰性，萬古黴素敏感。該類鏈球菌種較多，目前臨床僅鑒定到群，參見下表。

表                 草綠色鏈球菌的鑒定

注： a．+，陽性反應；一，陰性反應；土，有些菌株陽性而另外菌株陰性。

b．偶見例外。

c．變異鏈球菌群包括：倉鼠、道尼、野鼠，獼猴、鼠親緣鏈球菌，唾液鏈球菌群包括：腸、前腔鏈球菌，血液鏈球菌群包括：戈登、H．W群鏈球菌，緩症鏈球菌群包括：溫和、口腔、血鏈球菌生物'型鏈球菌，咽峽炎鏈球菌群包括：中間、星座、米勒鏈球菌。

 

咽峽炎鏈球菌是未分群的鏈球菌，被認為是“米勒鏈球菌”的同義詞，有β溶血的菌種，屬於A、C、F、G群，也有非β溶血菌種，在A、C、G群鏈球菌中有小菌落型菌株。非β溶血，帶有相同的Lancefield抗原，屬於草綠色鏈球菌(“米勒”群)細菌，有3個種；米勒鏈球菌、中間鏈球菌、星座鏈球菌。

1．乳球菌屬：原鏈球菌屬中乳鏈球菌現成為乳球菌屬。乳球菌和乳脂乳球菌在製酪和糧食工業生產中使用。臨床標本中也常見到。該屬菌種與腸球菌相似，唯一不同點是45℃不生長。

2．孿生球菌屬：原麻疹鏈球菌現轉入孿生球菌屬，另一種是溶血孿生球菌。該屬菌種曾從臨床標本中檢到，見於臨床感染如心內膜炎。其特點是生長緩慢，可能被誤認為營養缺陷鏈球菌，應用“衛星現象”試驗區別開來。菌種鑒定，參照下表所示。

表                      孿生球菌屬菌種鑒定

注：+，陽性；一，陰性；+’，弱陽性反應。

 

3．平麵球菌屬：該屬菌種對萬古黴素耐藥，PYR陰性，發酵葡萄糖不產氣，膽汁七葉苷、精氨酸陽性，含有D群抗原，不發酵乳糖，在含鹽肉湯中生長緩慢，屬內鑒別參見下表。乳酸平麵球菌和戊糖平麵球菌曾從臨床標本中分離到。

表                        平麵球菌屬菌種鑒定

注：+，陽性，一，陰性。

 

  4．無色藻菌屬：該屬菌種萬古黴素耐藥，PYR、LAP陰性，發酵葡萄糖(MRS肉湯)產氣，有4個菌種曾從臨床標本中檢到，種間鑒別參照下表。

表                         無色藻菌屬菌種鑒定

注：a.+，陽性；-，陰性；?，不了解；5％蔗糖，菌細胞外產生多糖(粘質物)

溶血性是鑒定球菌最常用的項目，也是鑒定過程中重要的一步。1919年Brown對溶血性進行了描述。

α溶血：或稱甲型溶血，在血平板上，菌落周圍部分紅細胞被破壞，呈現一個草綠色環。

β溶血：或稱乙型溶血，在血平板上，菌落周圍紅細胞完全溶解，呈現一個清楚透明溶血環。

γ溶血：或稱丙型溶血，血平板上，菌落周圍無紅細胞溶解，因而無溶血環。

溶血性的識別可在血平板表麵菌落周圍和穿刺處通過肉眼觀察，也可用顯微鏡觀察。除在分離血平板上觀察菌落周圍的溶血性外，還可用以下方法確認。

材料：羊血平板。

方法：將標本接種於羊血平板上，用接種針在已接種過的血平板上紮2～3處，使細菌被接種到瓊脂層深處，35℃孵育過夜。

觀察結果：在接種針穿刺過處，羊紅細胞完全溶解，形成無色透明區，為β溶血。羊紅細胞部分溶解或不溶解呈草綠色的環，為α溶血。不溶解無溶血環為γ溶血。

 

材料：Optochin  (ethylhydrocupreine HCI。)紙片(直徑6mm)，每片含5μg。血平板。

方法：挑取被檢菌落，塗在血平板上，貼 Optochin紙片於接種處，35℃，燭缸孵育18h。

觀察結果：抑菌環直徑≥14mm為敏感，推斷肺炎鏈球菌。

抑菌環直徑≤14mm時參照膽汁溶菌，或為其他草綠色鏈球菌。

 

材料：含0.04U／片的杆菌肽紙片，血平板。

方法：挑取被檢菌落，密塗於血平板上，接種量應大，以免出假陽性。貼上杆菌肽紙片，35℃過夜。

觀察結果：形成抑菌環為敏感，則被檢菌推斷為A群鏈球菌。

 

材料：血平板，金黃色葡萄球菌 ATCC25923。

方法：在血平板上，用金黃色葡萄球菌劃種一條直線，再將被檢菌距金黃色葡萄球菌 3mm處垂直接種一短線。用同樣方法接種陰性和陽性對照菌。35℃孵育過夜。

觀察結果：在被檢菌接種線與金葡菌接種線之間有一個矢形(半月形)加強溶血區，此即CAMP試驗陽性。陰性無加強溶血區。

 

培養基：      

牛肉膏          3g

七葉苷          1g

蛋白腖          5g

枸櫞酸鐵              0.5g

膽鹽                  40g

蒸餾水       1000ml

瓊脂                  1％

牛肉膏、蛋白腖和瓊脂溶於400ml蒸餾水中，膽鹽溶於400ml蒸餾水中，枸櫞酸鐵溶於l00ml蒸餾水中，三者混合，加熱充分溶解後，高壓滅菌121℃ 15min。七葉苷溶於l00ml蒸餾水，過濾除菌，以無菌手續加到培養基中，傾倒平皿或斜麵。

方法：接種被檢菌1—3個菌落，塗劃開，置35℃下，孵育24～48h。

觀察結果：培養基變黑色或棕褐色為陽性，不變色為陰性。

注意事項：接種細菌量不能過大。本試驗是測定細菌在膽鹽中生長情況及同時分解七葉苷的能力，如接種菌量過大，細菌不需要生長而本身固有的酶足以造成七葉苷分解，出現假陽性結果。

 

培養基：

蛋白腖        5g

七葉苷        3g

K₂HPO₄       1g

枸櫞酸鐵           0.5g

蒸餾水        1000ml

將上述成分加熱溶解，分裝試管，高壓滅菌12rClomin。

方法：接種被檢菌於培養基中，35℃過夜。

觀察結果：培養基變黑為陽性，不變為陰性。

 

培養基

NaCl              6.5g

牛肉粉          0.3g

葡萄糖          0.1g

蛋白腖          1g

瓊脂粉       1.8g

蒸餾水       l00ml

溴甲酚紫指示劑適量

調整pH7.4，121℃ 15min滅菌後製成平皿或斜麵。

方法：接種被檢菌，35℃孵育過夜。

觀察結果：培養基上生長出菌落並變黃色為陽性，不變色為陰性。

注意點：本試驗是測定細菌在高鹽中的生長能力，葡萄糖作為是否生長的指示劑。細菌接種量不能過大，否則細菌並不需要繁殖即可使葡萄糖產酸，培養基變色，導致假陽性結果。

 

色素試驗在鑒定B群鏈球菌的幾個方法中，特異性最好。這是Noble改良的Islam法。

培養基：

澱粉                     10g

腖                  23.0g

NaH₂PO₄                1.48g

Na₂HP0₄                 5.75g

瓊脂                  l0g

水               1000ml

調pH7.4，121℃15min滅菌後，加入 10ml滅活馬血清，傾製平板或高層瓊脂。接種細菌，35℃過夜培養。

觀察結果：細菌菌落及周圍的培養基呈黃色為陽性。