高生產率和高細胞密度發酵（下）

(三)誘導策略

      對於許多帶有誘導型啟動子的重組微生物，隻有將生長期和產物形成期分開才能獲得最大生產率。在流加培養中，這兩段時期的分離可以通過延遲誘導直至細胞生長已達到高密度來實現。此外，如果質粒穩定並且產物對培養物無毒，那麽可以用重複補料分批培養係統來提高生產率。有學者采用重複補料分批培養技術培養釀酒酵母，每24 h更換50%的培養基，持續30 d，其產物(hirudin)的產量可比連續培養係統提高3倍。

      如果誘導物和產物對細胞都有毒性，那麽應當人為地將誘導期和生長期分開。對於這種情況，兩級連續培養是最適宜的培養方式。控製第一罐的條件，使細胞生長處於最適狀態之下，而誘導與產物形成則發生在第二罐中。例如，在恒化器中培養一株能產b-內酰胺酶的重組大腸杆菌，將第一罐的發酵液導入第二罐中，構成一個兩級培養係統。第二罐中添加營養物以及IPTG作為誘導物。結果獲得300 mg活性b-內酰胺酶(相當於總蛋白的25%)，其中90%分泌至胞外。這一係統至少可以穩定運行50 d。另一相似的係統被用於培養大腸杆菌生產重組蛋白A-EcoRI蛋白融合體。培養在恒濁器中進行，對第二罐進行熱誘導，結果獲得了比分批發酵高6倍的比生產率。研究者還嚐試將生產重組蛋白的兩級連續培養係統與親和色譜柱相組合，試圖實現重組蛋白生產和純化的連續化。但由於技術上的一些原因，這種組合還未得到成功。

      比生長速率對細胞生長和產物形成均有重要作用。經常會遇到的情況是，最適於細胞生長的比生長速率卻並不適於產物的形成或其它特性的實現。我們在培養麵包酵母時發現，比生長速率為0.2 h-1時細胞產率最高，而比生長速率為0.178 h-1時酵母發酵活力最佳。針對這一現象我們提出了一個兩階段控製比生長速率的流加培養策略，結果在一個反應器中實現了高發酵活力與高細胞產率的統一。

(四)細胞循環發酵

       從反應器角度來考慮獲得高細胞密度，通常采用的是細胞循環生物反應器。這種反應器利用一種切向流或中空纖維過濾器從醪液中分離細胞，細胞返回容器，無細胞醪液則以給定速率連續轉移，同時代之以新鮮培養基。利用細胞循環技術，可使細胞保留在反應器中並達到高細胞密度，而毒性廢產物和胞外產物則不斷轉移，這可以延遲或防止由細胞生長或產物形成引起的反饋抑製。細胞循環生物反應器能夠適用於多種機體和生產係統，但它的應用也存在許多限製，主要包括∶(1)作用於進入過濾單元的細胞的剪應力太大；(2)係統的放大存在許多實際困難。

      操作細胞循環生物反應器時必須考慮兩個因素，一是稀釋率(流速／體積)；二是循環速率(指通過過濾係統的培養基速率)。稀釋率的大小影響細胞的生長速率，不同的實驗目的對稀釋率的要求也不同；高的循環速率可使組分混合均勻，特別適用於細胞容易凝聚或成團的情況。但循環速率過高會使作用在細胞上的剪切力過高，也會導致過濾單元膜的迅速損壞。因此，很難同時確定合適的稀釋率與循環速率，這也是限製細胞循環技術應用的一個重要因素。

      細胞循環技術可望獲得高的體積生產率，這對產物的提取非常有利。近年來循環發酵技術已廣泛用於生產細胞代謝物，如燃料酒精和有機酸(如丁酸)及2,3-丁二醇。Lee和Chang采用細胞循環發酵技術，重組大腸杆菌細胞幹重達到145 g/L，其重組青黴素酰化酶生產率比分批培養提高了近10倍。對於活細胞即為所希望的產物的培養，細胞循環發酵也能發揮作用。如在食品工業中，為生產牛奶，奶酪和酸乳酪需培養不同的乳杆菌，采用細胞循環生物反應器可以很容易地提高這些生物體的的密度。

      在多種控製手段的幫助下，目前人們已經能很容易地獲得超過100 g/L的細胞密度。但已有的研究結果表明，與最適生物量形成所對應的生長條件通常會導致較低的比生產率。例如，用細胞循環反應器生產2,3-丁二醇，生物量提高了大約6倍，但體積生產率隻提高了2～3倍。同樣，流加培養可以使鏈黴菌的細胞幹重達到43 g/L，但蛋白酶活為零，而當細胞幹重為18 g/L時蛋白酶活卻高達3500 U/mL。我們在研究中也經常遇到類似問題。要解決這一問題，一方麵應當研究如何促進重組蛋白的高效表達和提高重組菌株的穩定性，另一方麵要研究與高細胞密度相關聯的高水平產物的形成條件。