高生產率和高細胞密度發酵（上）

生物技術研究者追求的兩個主要目標，一是新型生物產品的開發，另一就是為傳統的或新生生物產品，尋求更經濟的生產方式。近十年來，利用遺傳工程技術來生產一些重要的生物藥物，是生物技術領域中迅速發展的一個重要方向。在這一研究領域裏，如何創造更經濟、更有效的方法，來提高生產過程的經濟性和產品的市場競爭力，已經成為生物技術領域的科學家們所關注的焦點問題。

利用重組DNA技術生產重要的生物藥物，在人類文明史上具有劃時代的意義。由於生產成本和生產率的高低直接影響公司的生存，重組生物藥物生產過程的優化已經成為一個重要問題。它包括以下六個方麵∶(1)適宜宿主的選擇；(2)重組蛋白積累位點(如可溶的胞內積累、胞內聚合積累、周質積累或胞外積累)的確定；(3)重組基因最大表達的分子策略；(4)細胞生長和生產環境的優化；(5)發酵條件的優化；後處理過程的優化。隻有這六個方麵都以實現高生產率為目標，整個生產過程的最優化才能實現。

(一)細胞生長環境的優化策略

要提高細胞密度和生產率，首先需要對微生物生長的物理和化學環境進行優化，包括生長培養基的組成，培養物理參數(pH、溫度和攪拌)及產物誘導條件。優化這些參數的目的在於保證細胞生長處於最適的環境條件之下，避免營養物過量或不足、防止產物降解以及減少有毒產物的形成。

1．培養基組成的優化

培養基中通常含有碳(能)源、氮源，以及微營養物如維生素和微量元素，這些營養物的濃度與比例，對實現生產重組微生物的高密度發酵是很重要的。例如，過量的Fe²⁺和CaCO₃與相對低濃度的磷酸鹽可促進黃曲黴生產L-蘋果酸；鏈黴菌在60～80 mmol/L CO₃^2-存在下，其絲氨酸蛋白酶生產能力可提高10倍之多；在重組微生物達到高細胞密度後，限製磷酸鹽濃度可使抗生素和異源白介素b的產率顯著提高。此外還發現，限製精氨酸的濃度雖然會抑製細胞的生長，但比起精氨酸充足時細胞生長優良的情況，其重組a-澱粉酶的產量可提高2倍。

培養基中複合氮源的種類對重組大腸杆菌的高密度發酵也非常重要。一般地，當流加培養基中含有酵母膏時，重組蛋白不穩定；而當流加培養基中含有蛋白腖時，大腸杆菌不能再利用其所產生的乙酸。將酵母膏和蛋白腖都加入流加培養基中，不但所生產的重組蛋白非常穩定，細胞還能再利用代謝合成的乙酸，這是一種非常有趣的代謝機製。

恒化技術可用於優化精氨酸營養缺陷型大腸杆菌X90的生長培養基。使該菌株以0.4 h-1的比生長速率在含精氨酸的基本培養基上生長，待培養達到穩定狀態後，在恒化器內分別加入氨基酸、維生素和微量元素來考察這些物質對菌體生長和精氨酸合成的影響。結果表明，由於氨基酸生物合成途徑的末端產物抑製作用，加入某些氨基酸後，細胞生長反而受到抑製。加入NH₄Cl後細胞量則出現了戲劇性的增長。而添加維生素對菌體生長基本上沒有任何影響。通過計算生物量對每種基質的產率，最終可以確定高密度發酵培養基的組成，在此優化培養基上，大腸杆菌X90細胞密度可達到92 g/L，同時形成56 mg/L的胞外重組蛋白酶。

2．特殊營養物的添加

在某些情況下，向培養基中添加一些營養物質能提高生產率。這些營養物的作用有可能是作為產物的前體，也有可能是阻止產物的降解，例如，在培養重組大腸杆菌生產氯黴素乙酰轉移酶(一種由許多芳香族氨基酸組成的蛋白)時添加苯丙氨酸，可將酶的比活力提高大約2倍；在培養重組枯草芽孢杆菌生產b-內酰胺酶的培養基中添加60 g/L的葡萄糖和100 mmol/L的磷酸鉀能使重組蛋白的穩定性顯著提高。其原因可能是由於宿主細胞產生的多種胞外蛋白酶的活性被抑製，從而防止了重組蛋白的降解。

在生長培養基中添加特殊物質有時還能以一種未知的機製提高生產率。例如，在搖瓶培養Micromonospora cbersina時添加碘化鈉可使dynemicin A的產量提高35倍，但在小型反應器中卻無法重複這一結果。

3．限製代謝副產物的積累

培養條件的控製對代謝副產物的形成影響甚大。在分批或流加培養中，某些營養物的濃度過高均會導致Crabtree效應的產生。在這種效應下，釀酒酵母會產生乙醇，大腸杆菌則會產生過量乙酸，一旦生成乙酸，細胞生長及重組蛋白的生產均會受到抑製。大腸杆菌形成乙酸的速度依賴於細胞的生長速度和培養基的組成。業已確證，如果在培養基中添加複合營養物(如大豆水解物)，則會增加乙酸的積累量。針對如何減輕由於乙酸積累而產生的負麵影響，眾多研究者進行了大量工作，如利用循環發酵技術來限製乙酸在重組大腸杆菌高密度培養中的積累。近來也有研究表明，添加某些氨基酸能減輕乙酸的抑製作用。如在培養基中添加10 mg/L的甘氨酸能顯著促進大腸杆菌合成重組a-澱粉酶和b-內酰胺酶，並能刺激酶從周質向培養基中釋放，但此時仍有乙酸伴隨生成。

(二)培養模式

由於許多營養物在高濃度下對細胞有抑製作用，而為了達到高細胞密度，又必須供給大量的營養物質，因此，濃縮營養物必須以與其消耗速率成比例的速度加入反應器中。為此產生了多種形式的補料策略，它可以簡單到線性補料，也可以複雜到利用數學模型計算得出的策略來控製補料速率。具體來說，培養模式的選擇主要依賴於以下三個因素∶(1)所培養細胞的具體代謝行為；(2)利用抑製性底物合成目的產物的潛力；(3)誘導條件以及測量細胞培養各項參數的能力。

1．大腸杆菌流加發酵策略

大腸杆菌是迄今為止遺傳背景最清楚的菌株，廣泛用於基因工程的研究中。大腸杆菌高密度培養時最關鍵的問題是如何盡量減少乙酸的產生，因為高濃度葡萄糖或高比生長速率帶來的高濃度乙酸會嚴重抑製細胞生長和重組蛋白的生產。研究發現，即使葡萄糖濃度隻有0.25～0.5 g/L，大腸杆菌仍會產生乙酸。因此，高細胞密度發酵所采用的流加策略必須按照一定的算法製定，以保持反應器中底物濃度處於較低的水平。營養物最好以它們的消耗速率加入反應器中，這樣不僅可以防止底物積累到毒性水平，也不會使細胞處於饑餓狀態。

近年來已經報道了多種控製大腸杆菌流加培養中流加速率的方法，其中大多數是將流加速率與一種物理參數間接耦合(如溶氧、pH或CO₂釋放速率)。有學者將溶氧控製在一個預定值上以保證較低的生長速率，結果乙酸產生很少，最終細胞幹重達到110 g/L，並發現較低的比生長速率還有利於重組蛋白的高表達。在另一個控製低比生長速率的高細胞密度培養中，研究者采用先指數流加葡萄糖、銨鹽和無機鹽，後采用廣義線性流加的培養策略，有效地防止了乙酸的積累，重組大腸杆菌的細胞密度達到66 g/L，通過溫度誘導可在胞內形成19.2 g/L的活性重組蛋白。

如果將葡萄糖濃度控製在一個不致於產生毒性的足夠低的水平上，也可以使細胞在不存在限製性基質的情況下迅速生長到高細胞密度。這種控製策略對儀器的要求較高。Kleman等采用在線葡萄糖分析儀，以微生物對葡萄糖的需求來決定葡萄糖和其它營養物的流加速率，這一算法能夠在產物誘導階段中根據細胞生長的變化自動調整流加速率。培養攜帶質粒的大腸杆菌 MV1190，其質粒中帶有編碼1,5-二磷酸核酮糖羧化酶的基因，最終細胞幹重達到39 g/L，產生1.7 g/L可溶的活性蛋白。

2．重組酵母的流加發酵

酵母中廣泛用於遺傳工程研究的菌株是釀酒酵母。但采用釀酒酵母作為重組宿主也有以下缺點∶(1)重組蛋白生產的水平較低；(2)質粒不穩定；(3)生成乙醇。其中生成乙醇是研究者最不希望出現的，因為這會抑製重組蛋白的形成。近來研究表明，其它酵母，如巴斯德畢赤氏酵母也具有作為重組宿主的潛力。Clare等比較了重組巴斯德畢赤氏酵母和釀酒酵母在高細胞密度狀態下表達和分泌鼠表皮生長因子的能力。培養每基因組含有19個拷貝數的巴斯德畢赤氏酵母，最終可獲得447 mg/L胞內重組蛋白；而培養釀酒酵母所獲得的最高水平僅6～7 mg/L。

通過先指數流加，後采用基於CO2釋放和RQ值的線性流加控製方式可使重組巴斯德畢赤氏酵母的細胞幹重達到80～90 g/L，並分泌高水平的重組人血清蛋白。而培養釀酒酵母，細胞幹重和重組蛋白的產量僅分別為25 g/L和20 mg/L。即使將釀酒酵母的生長速率維持在0.12～0.18 h-1，也將形成10～13 g/L的乙醇，因而導致產率降低。但釀酒酵母產乙醇也並不是不可控製的。Shimizu等采用一個複雜的流加係統，將酵母的生長速率控製在0.3 h-1，可使穀胱甘肽(GSH)的生產最大而乙醇的生成最小。

3．流加培養的控製

一個好的流加控製係統必須避免兩種傾向∶一是流加過量，補料組分在反應器中積累從而對細胞生長和產物形成產生抑製；二是流加不足，這可能會導致細胞必需營養物的缺乏。計算機技術的迅猛發展，為流加培養的控製提供了更有效的手段。近年來，應用計算機技術來監測和控製發酵過程的研究屢見報道。由於現代計算機技術的幫助，人們能夠采用多種生長參數和數學模型來控製流加培養中營養物的添加，從而使複雜的控製係統得以實現。在各種人工智能技術中，模糊推理(fuzzy reasoning)是應用最廣的一種。模糊邏輯控製(fuzzy logic control)部分依賴於數學生長模型，也采用“語言定義的規則係統”(linguistically defined rules system)來幫助係統響應發酵過程的非線性和動態行為。Alfafara等在流加培養釀酒酵母生產穀胱甘肽的研究中，采用一個模糊邏輯控製係統來控製葡萄糖的流加速度，對係統進行優化後穀胱甘肽的比產生速率達到6.2 h-1。目前，在流加培養中應用模糊邏輯控製技術的最大問題在於如何減少底物和產物濃度振蕩所需的調整次數。自適應模糊邏輯控製算法的發展可望對此有所幫助。