工業微生物產生菌的篩選（七）

（四）組織分離法

組織分離法是由一些有病組織或特殊組織中分離菌株的方法。如從患惡苗病的水稻組織中分離赤黴素，從根瘤中分離根瘤菌及從各種食用菌的子實體中分離孢子等。

1. 對一般有病組織的分離方法

切除小塊含菌組織，用幹淨水洗去組織表麵汙物。以10％漂白粉或0.1％升汞浸泡2～5分鍾進行表麵消毒，無菌水衝洗。將消毒後的組織移到平皿培養基上，置於適宜溫度（25～26℃）培養一定時間，即可在組織周圍四÷長出微生物。用肉眼或顯微鏡觀察菌落，基本確認後挑入斜麵培養基中培養。由這種方法挑選的菌株往往不純，必須在瓊脂平板上再分離純化，然後挑取單個菌落於斜麵，進一步篩選。
從豆科植物的根瘤中分離根瘤菌：取新鮮健壯的根瘤，經漂白粉或升汞溶液等進行表麵消毒後，用無菌鑷子將根瘤壓破，取出汁液少許與分離培養基混合倒入平皿中，攤平，培養後在平板上長出菌落，經鏡檢觀察後確認典型菌落，移入斜麵。

2. 食用菌孢子分離法

食用菌的孢子分離法通常有兩種，即多孢子分離和單孢子分離。多孢子分離有混雜現象，不易篩選到優良穩定的菌株。因此，從育種角度最好采用單孢子分離。兩種方法的分離步驟、方法介紹如下：

（1）多孢子分離法

取產量高、朵大、健壯無病並即將成熟的初生和單生子實體，用清水洗淨表麵汙物，對子實體外有膜保護著的菇類，如蘑菇、草菇，在0.1%～0.2%升汞溶液浸泡2～3 min，用無菌水衝洗數次。對子實體無膜外露的平菇等，不適於用升汞溶液浸泡，要用75%的酒精進行表麵消毒，再用無菌水衝洗。食用菌的孢子著生在子實體的腹麵的菌褶上，成熟時會自動彈出來。孢子采集裝置：用一條兩端彎成鉤的鐵絲，一端鉤著一塊成熟的蠶豆大子實體，另一端掛在三角瓶的瓶口上。三角瓶內事先製備好馬鈴薯—蔗糖培養基平板。懸掛的子實體距離培養基平板2～3cm。適溫培養1～2天，就有孢子陸續彈落於三角瓶底部的培養基上，經過4～5天，孢子萌芽成菌絲，及時將菌絲尖端接入到斜麵培養基上培養，然後進行生產性能對比試驗。

（2）單孢子分離法

取一條鐵絲，彎曲成蚊香支架形狀，放在已消毒的玻璃板上。將消毒後的子實體懸掛在支架上方，下方置一個已滅菌的去蓋的培養皿，然後罩一個鍾罩，周圍縫隙用凡士林封好。將這套孢子收集器移到恒溫室內培養1～2天，將有大量孢子彈到平皿上，收集孢子。以上操作全部在超淨台或無菌室內進行。將收集到的孢子用稀釋法在馬鈴薯—蔗糖培養基平板上進行單孢子分離，培養後把單孢子長出的菌落移接到斜麵上，進行生產性能比較試驗。

（五）單細胞或單孢子分離法

采用特殊的儀器設備進行單細胞或單孢子的分離。具體方法有多種，現主要介紹檸檬酸產生菌采用的小滴分離純化方法。操作如下：將待純化的孢子懸液稀釋約為1500ml-1，用校正口徑的滴管（每毫升400滴）吸取孢子並均勻滴於無菌幹燥蓋玻片上，將其小心翻轉於凹玻片的孔穴上，穴內加一滴已滅菌的培養液，蓋玻片和載玻片用凡士林密封。顯微鏡下觀察每個小滴，將隻有一個孢子的小滴位置作好記錄，恒溫培養，挑取單菌落於斜麵。
除用凹玻片，還可用濾紙進行單細胞或單孢子分離。具體作法如下：取與皿內徑大小一致的濾紙3～4層，浸在培養液中，取出放在空皿內，在濾紙上滴幾滴甘油以防幹燥，蓋好皿蓋，滅菌。將稀釋為1500ml-1的孢子懸液用上述滴管滴在濾紙上，每皿約點20點滴左右，經恒溫培養，每滴約出現10個菌落，將單菌落移接於斜麵上。該方法能夠得到單細胞或單孢子，較為精確，但操作時要細，否則不易得到理想結果。