Ⅲ級生物安全櫃用於操作危險度4級的微生物材料，可以提供最好的個體防護。Ⅲ級生物安全櫃的所有接口都是“密封的”，其送風經HEPA過濾，排風則經過兩個HEPA過濾器。Ⅲ級生物安全櫃由一個外置的專門的排風係統來控製氣流，使安全櫃內部始終處於負壓狀態（大約124.5 Pa）。隻有通過連接在安全櫃上的結實的橡膠手套，手才能伸到工作台麵。Ⅲ級生物安全櫃應該配備一個可以滅菌的、裝有HEPA過濾排風裝置的傳遞箱。Ⅲ級生物安全櫃可以與一個雙開門的高壓滅菌器相連接，並用它來清除進出安全櫃的所有物品的汙染。可以將幾個手套箱連在一起以增大工作麵積。Ⅲ級生物安全櫃適用於三級和四級生物安全水平的實驗室。
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