Ⅱ級A1型生物安全櫃內置風機將房間空氣（供給空氣）經前麵的開口引入安全櫃內並進入前麵的進風格柵。在正麵開口處的空氣流入速度至少應該達0.38 m/s。然後，供氣先通過供風HEPA過濾器，再向下流動通過工作台麵。空氣在向下流動到距工作台麵大約6～18 cm處分開，其中的一半會通過前麵的排風格柵，而另一半則通過後麵的排風格柵排出。所有在工作台麵形成的氣溶膠立刻被這樣向下的氣流帶走，並經兩組排風格柵排出，從而為實驗對象提供最好的保護。氣流接著通過後麵的壓力通風係統到達位於安全櫃頂部、介於供風和排風過濾器之間的空間。由於過濾器大小不同，大約70%的空氣將經過供風HEPA過濾器重新返回到生物安全櫃內的操作區域，而剩餘的30%則經過排風過濾器進入房間內或被排到外麵。
Ⅱ級A1型生物安全櫃排出的空氣可以重新排入房間裏，也可以通過連接到專用通風管道上的套管或通過建築物的排風係統排到建築物外麵。
安全櫃所排出的經過加熱和∕或冷卻的空氣重新排入房間內使用時，與直接排到外麵環境相比具有降低能源消耗的優點。有些生物安全櫃通過與排風係統的通風管道連接，還可以進行揮發性放射性核素以及揮發性有毒化學品的操作。
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