農藥殘留——丁嘧脲檢測方法

1．分析目標化合物

    丁嘧脲, 丁嘧脲尿素體, 丁嘧脲甲烷亞氨基酰胺體

2．儀器設備

    帶堿熱離子檢測器或高靈敏度氮磷檢測器的氣相色譜儀、帶紫外分光光度檢測器的高效液相色譜儀、氣相色譜-質譜儀和液相色譜-質譜儀。

3．試劑
 
    L-半胱氨酸鹽酸鹽溶液

   碳酸鉀溶液

   乙腈

   2％二甘醇丙酮溶液

   乙醚

   正己烷

    0.1mol/L 乙酸緩衝溶液(pH5.0)：在0.1mol/L乙酸鈉溶液中加入0.1mol/L乙酸溶液，調整pH5.0。
    丁嘧脲標準溶液：在10.0mg丁嘧脲中加入乙腈至200mL，吸取其10mL，加入乙腈：水(9：1)混合溶液至100mL。

4．標準品

    丁嘧脲標準品：含丁嘧脲99％以上，熔點為145℃～148℃。
    1－特丁基－3－(2，6－二異丙基－4－苯氧基苯基)尿素(以下稱“尿素體”。)標準品：含尿素體97％以上，熔點為180℃～181℃。
    1－特丁基－3－(2，6－二異丙基－4－苯氧基苯基)甲烷亞氨基酰胺(以下稱“甲烷亞氨基酰胺體”。)標準品 ：含甲烷亞氨基酰胺體97％以上，熔點為126℃～127℃。

5．試驗溶液的製備

a 丁嘧脲試驗溶液
① 提取方法
（I）種子類
    將樣品粉碎通過420μm的標準網篩後，稱取其8.00g於300mL具塞的棕色三角瓶中，加入15mL 30％L-半胱氨酸鹽酸鹽溶液和15mL 1mol/L碳酸鉀溶液,放置2小時。
    加入80mL乙腈，振搖30分鍾後，用玻璃纖維濾紙抽濾至200mL棕色三角瓶中，濾紙上的殘留物中加入30mL乙腈洗滌，合並洗液於棕色三角瓶中，移入200mL具塞棕色容量瓶中，加水至200mL。吸取其100mL，加入40mL水。
（II）水果和蔬菜
    將樣品攪碎後，稱取其20.0g於300mL具塞的棕色三角瓶中，加入10mL 30％L-半胱氨酸鹽酸鹽溶液、10mL 1mol/L碳酸鉀溶液和80mL乙腈，攪拌1分鍾後，振蕩30分鍾，用玻璃纖維濾紙抽濾至200mL棕色三角瓶中。濾紙上的殘留物中加入30mL乙腈洗滌，合並洗液於棕色三角瓶中，移入200mL具塞棕色容量瓶中，加水至200mL。吸取其100mL，加入40mL水。
（III）茶
    樣品粉碎後，稱取其5.00g於300mL具塞的棕色三角瓶中，加入10mL 30％L-半胱氨酸鹽酸鹽溶液和10mL 1mol/L碳酸鉀溶液, 放置2小時。
加入80mL乙腈，振搖30分鍾後，用玻璃纖維濾紙抽濾至200mL棕色三角瓶中，濾紙上的殘留物中加入30mL乙腈洗滌，合並洗液於棕色三角瓶中，移入200mL具塞棕色容量瓶中，加水至200mL。吸取其80mL，加入30mL水。
② 淨化方法
（I）種子類、水果和蔬菜
    在用鋁箔包裹避光的環已基甲矽烷基化矽膠小柱(1,000mg)中注入10mL乙腈，棄去流出液。再注入10mL水，棄去流出液。柱中注入① 提取方法所得的溶液後，棄去流出液。注入10mL乙腈：水(2：3)混合溶液，棄去流出液。注入4mL乙腈，收集流出液於具刻度的棕色玻璃試管中，加入乙腈，準確至4mL，此為試驗溶液。
（II）茶
    在用鋁箔包裹避光的環已基甲矽烷基化矽膠小柱(2,000mg)中注入10mL乙腈，棄去流出液。再注入10mL水，棄去流出液。柱中注入① 提取方法所得的溶液後，棄去流出液。注入10mL乙腈：水(2：3)混合溶液，棄去流出液。再注入15mL乙腈：水(4：1)混合溶液，收集流出液。加入15mL水。
    氨基丙基甲矽烷基化矽膠小柱(1,000mg)下麵連接環已基甲矽烷基化矽膠小柱(1,000mg)。注入10mL乙腈，棄去流出液。再注入10mL水，棄去流出液。注入上述溶液後，棄去流出液。再注入10mL乙腈：水 (2：3) 混合溶液，棄去流出液。取下棄去氨基丙基甲矽烷基化矽膠小柱。環已基甲矽烷基化矽膠小柱中注入10mL乙腈：水(1：1)混合溶液，棄去流出液。注入4mL乙腈，收集流出液於具刻度的棕色玻璃試管中，加入乙腈，準確至4mL，此為試驗溶液。
b 尿素體試驗溶液
① 提取方法
（I）種子類
    將樣品粉碎通過420μm的標準網篩後，稱取其8.00g於300mL具塞的棕色三角瓶中，加入15mL 30％L-半胱氨酸鹽酸鹽溶液和15mL 1mol/L碳酸鉀溶液,放置2小時。
    加入80mL乙腈，振搖30分鍾後，用玻璃纖維濾紙抽濾至棕色三角瓶中，濾紙上的殘留物中加入30mL乙腈洗滌，合並洗液於棕色三角瓶中，移入200mL具塞棕色容量瓶中，加水至200mL。吸取其100mL，加入40mL水。
（II）水果和蔬菜
    將樣品攪碎後，稱取其20.0g於300mL具塞的棕色三角瓶中，加入10mL 30％L-半胱氨酸鹽酸鹽溶液、10mL 1mol/L碳酸鉀溶液和80 mL乙腈，攪拌1分鍾後，振蕩30分鍾，用玻璃纖維濾紙抽濾至200mL棕色三角瓶中，濾紙上的殘留物中加入30mL乙腈洗滌，合並洗液於棕色三角燒瓶中，移入200mL具塞棕色容量瓶中，加水至200mL。吸取其100mL，加入40mL水。
（III）茶
    樣品粉碎後，稱取其5.00g於300mL具塞的棕色三角燒瓶中，加入10mL 30％L-半胱氨酸鹽酸鹽溶液和10mL 1mol/L碳酸鉀溶液, 放置2小時。
加入80mL乙腈，振搖30分鍾後，用玻璃纖維濾紙抽濾至棕色三角瓶中，濾紙上的殘留物中加入30mL乙腈洗滌，合並洗液於棕色三角瓶中，移入200mL具塞棕色容量瓶中，加水至200mL。吸取其80mL，加入30mL水。
② 淨化方法
（I）種子類
    在用鋁箔包裹避光的環已基甲矽烷基化矽膠小柱(1,000mg)中注入10mL乙腈，棄去流出液。再注入10mL水，棄去流出液。柱中注入① 提取方法所得的溶液後，棄去流出液。注入10mL乙腈：水(2：3)混合溶液，棄去流出液。注入4mL乙腈，收集流出液於具刻度的棕色玻璃試管中，加入乙腈至4mL。移取3mL溶液於棕色磨口減壓濃縮器中，加入0.5mL 2％二甘醇丙酮溶液，40℃以下除去乙腈。殘留物中加入2mL乙醚：正己烷(3：17)混合溶液溶解。
    矽膠小柱(避光，690mg)中注入5mL正己烷，棄去流出液。柱中注入上述溶液，棄去流出液。注入8mL乙醚：正己烷(3：17)混合溶液，棄去流出液。在此柱的下部先注入5mL正己烷，棄去流出液，連接氨基丙基甲矽烷基化矽膠小柱(360mg)。矽膠小柱中再注入20mL乙醚：正己烷(2：3)混合溶液，收集流出液於磨口減壓濃縮器中，40℃以下除去乙醚和正己烷，殘留物中加入乙腈溶解，準確至2mL，做為試驗溶液。試驗溶液製備後必須立即測定。
（II）水果和蔬菜
    環已基甲矽烷基化矽膠小柱(遮光、1,000mg)中注入10mL乙腈，棄去流出液。再注入10mL水，棄去流出液。柱中注入① 提取方法所得的溶液後，棄去流出液。再注入10mL乙腈：水(2：3)混合溶液，棄去流出液。注入4mL乙腈，收集流出液於具刻度的棕色玻璃試管中，加入乙腈至4mL。移取2mL溶液於棕色磨口減壓濃縮器中，加入0.5mL2％二甘醇丙酮溶液，40℃以下除去乙腈。殘留物中加入2mL乙醚：正己烷(3：17)混合溶液溶解。
    矽膠小柱(避光690mg)中注入5mL正己烷，棄去流出液。在柱中注入上述溶液，棄去流出液，注入8mL乙醚：正己烷(3：17)混合液，棄去流出液。此柱的下部連接預先注入5mL正己烷，棄去流出液的氨基丙基甲矽烷基化矽膠小柱(360mg)。矽膠小柱中再注入20mL乙醚：正己烷(2：3)混合溶液，收集流出液於磨口減壓濃縮器中，40℃以下除去乙醚和正己烷。殘留物中加入乙腈溶解，準確至2mL，此為試驗溶液。試驗溶液製備後必須立即測定。
（III）茶
     環已基甲矽烷基化矽膠小柱(遮光、2,000mg)中注入10mL乙腈，棄去流出液。再注入10mL水，棄去流出液。柱中注入① 提取方法所得的溶液後，棄去流出液。注入10mL乙腈：水(2：3)混合液，棄去流出液。再注入15mL乙腈：水(4：1)混合液，收集流出液，加入15mL水。
     氨基丙基甲矽烷基化矽膠小柱(遮光，1,000mg)下麵連接環已基甲矽烷基化矽膠小柱(遮光1,000mg)。注入乙腈10mL，棄去流出液。再注入水10mL，棄去流出液。柱中注入上述溶液後，棄去流出液。注入10mL乙腈：水(2：3) 混合溶液，棄去流出液後，取下棄去氨基丙基甲矽烷基化矽膠小柱。環已基甲矽烷基化矽膠小柱中注入10mL乙腈：水(1：1)混合溶液，棄去流出液。再注入4mL乙腈，收集流出液於具刻度的棕色玻璃試管中，加入乙腈，準確至4mL。移取2mL溶液於棕色磨口減壓濃縮器中，加入0.5mL 2％二甘醇丙酮溶液，40℃以下除去乙腈。殘留物中加入2mL乙醚：正己烷(3：17)混合溶液溶解。
    矽膠小柱(遮光、690mg)中注入5mL正己烷，棄去流出液。柱中注入上述溶液，棄去流出液。注入8mL乙醚：正己烷(3：17)混合溶液，棄去流出液。此柱的下部連接預先注入5mL正己烷，棄去流出液的氨基丙基甲矽烷基化矽膠小柱(360mg)。矽膠小柱中再注入20mL乙醚：正己烷(2：3)混合溶液，收集流出液於磨口減壓濃縮器中，40℃以下除去乙醚和正己烷。殘留物中加入乙腈溶解，準確至2mL，此為試驗溶液。試驗溶液製備後必須立即測定。
c 甲烷亞氨基酰胺體試驗溶液
① 提取方法
（I）種子類
    將樣品粉碎通過420μm的標準網篩後，稱取其8.00g於300mL具塞的棕色三角瓶中，加入15mL 30％L-半胱氨酸鹽酸鹽溶液和15mL 1mol/L碳酸鉀溶液,放置2小時。
    加入80mL乙腈，振搖30分鍾後，用玻璃纖維濾紙抽濾至棕色三角瓶中，濾紙上的殘留物中加入30mL乙腈洗滌，合並洗液於棕色三角瓶中，移入200mL具塞棕色容量瓶中，加水至200mL。吸取其100mL，加入40mL水。
（II）水果和蔬菜
    將樣品攪碎後，稱取其20.0g於300mL具塞的棕色三角瓶中，加入10mL 30％L-半胱氨酸鹽酸鹽溶液、10mL 1mol/L碳酸鉀溶液和80mL乙腈，攪拌1分鍾後，振蕩30分鍾，用玻璃纖維濾紙抽濾至棕色三角瓶中，濾紙上的殘留物中加入30mL乙腈洗滌，合並洗液於棕色三角瓶中，移入200mL具塞棕色容量瓶中，加水至200mL。吸取其100mL，加入40mL水。
（III）茶
    樣品粉碎後，稱取其5.00g於300mL具塞的棕色三角瓶中，加入10mL 30％L-半胱氨酸鹽酸鹽溶液和10mL 1mol/L碳酸鉀溶液, 放置2小時。
加入80mL乙腈，振搖30分鍾後，用玻璃纖維濾紙抽濾至棕色三角瓶中，濾紙上的殘留物中加入30mL乙腈洗滌，合並洗液於棕色三角瓶中，移入200mL具塞棕色容量瓶中，加水至200mL。吸取其80mL，加入30mL水。
② 淨化方法
    在十八烷基甲矽烷基化矽膠小柱(避光1，000mg)中注入10mL乙腈,棄去流出液。再注入30mL水，棄去流出液。柱中注入① 提取方法所得的溶液後，棄去流出液。注入30mL水，棄去流出液。注入10mL乙腈，棄去流出液。再注入20mL乙腈：0.1mol/L乙酸緩衝溶液(pH5.0) (4：1)的混合溶液,收集流出液於100mL三角瓶中。 
    流出液中加入100mL 5％氯化鈉溶液,再用50mL乙酸乙酯：正己烷(1：1)混合溶液移入200mL分液漏鬥中, 用振蕩器激烈振蕩5分鍾後，靜置，乙酸乙酯和正己烷層移入200mL三角瓶中。水層中加入50mL乙酸乙酯：正己烷(1：1)混合溶液，按上述同樣方法操作，合並乙酸乙酯和正己烷層於上述三角瓶中。加入適量無水硫酸鈉，不時振蕩、混合，放置15分鍾後，濾入磨口減壓濃縮器中。再用20mL乙酸乙酯：正己烷(1：1)混合溶液洗滌三角瓶，以此洗滌液洗滌濾紙上的殘留物，重複操作二次，合並二洗滌液於減壓濃縮器中，加入0.5mL2％二甘醇丙酮溶液，40℃以下除去乙酸乙酯和正己烷。殘留物中加入丙酮溶解，準確至3mL，此為試驗溶液。

6．操作方法

a 定性試驗
① 丁嘧脲試驗
    用帶紫外分光光度檢測器的高效液相色譜儀，按下列操作條件進行試驗。試驗結果必須與丁嘧脲標準溶液的一致。
操作條件
柱填充劑：十八烷基甲矽烷基化矽膠(粒度5μm，細孔徑30nm)。
柱：內徑6mm，長150mm不鏽鋼管。
柱溫： 40℃
檢測器：波長256nm。
流動相：乙腈：水：甲醇(2：2：1)混合溶液。調整流速使丁嘧脲約32分鍾流出。
② 尿素體試驗
    用帶紫外分光光度檢測器的高效液相色譜儀，按下列操作條件進行試驗。試驗結果必須與標準品的一致。
操作條件
柱填充劑：十八烷基甲矽烷基化矽膠(粒度5μm)。
柱：內徑6mm，長150mm不鏽鋼管。
柱溫： 40℃
檢測器：波長235nm。
流動相：乙腈：水：甲醇(2：2：1)混合溶液。調整流速使尿素體約20分鍾流出。
③甲烷亞氨基酰胺體試驗 
    用帶堿熱離子檢測器或高靈敏度氮磷檢測器的氣相色譜儀，按下列操作條件進行試驗。試驗結果必須與標準品的一致。
操作條件
柱：內徑0.25mm、長30m的石英毛細管，塗布0.25μm厚氣相色譜用50%苯基--甲基矽酮，老化。
柱溫：在100℃保持1分鍾，此後每分鍾升溫30℃。達到280℃後保持4分鍾。
進樣器溫度：250℃ 
檢測器溫度：280℃ 
氣體流量：以氦氣為載氣。調整流速使甲烷亞氨基酰胺體約10分鍾流出。調節空氣和氫氣的流量至適當條件。
b 定量試驗
    根據與a 定性試驗相同操作條件所得試驗結果，用峰高法或峰麵積法對丁嘧脲、尿素體和甲烷亞氨基酰胺體進行定量，求出各含量，按下式求出包括尿素體和甲烷亞氨基酰胺體的的丁嘧脲含量。
丁嘧脲的含量(包適尿素體和甲烷亞氨基酰胺體)＝A＋B×1.04＋C×1.09
A：丁嘧脲的含量(mg/kg)
B：尿素體的含量(mg/kg)
C：甲烷亞氨基酰胺體的含量(mg/kg)
c 確證試驗
    對於丁嘧脲和尿素體的試驗溶液，按照與a 定性試驗相同的操作條件，用液相色譜--質譜儀測定。試驗結果必須與標準品的一致。此外，必要時用峰高法和峰麵積法進行定量。
    對於甲烷亞氨基酰胺體的試驗溶液，按照與a 定性試驗相同的操作條件，用氣相色譜--質譜儀測定。試驗結果必須與標準品的一致。此外，必要時用峰高法和峰麵積法進行定量。

7．定量限   
 
    水果和蔬菜：0.02 mg/kg，種子：0.04 mg/kg，茶：0.2 mg/kg

8．注意事項

1）分析值
    對丁嘧脲、尿素體和甲烷亞氨基酰胺體分別進行定量，將尿素體和甲烷亞氨基酰胺體含量乘以係數換算成丁嘧脲的含量。它們的和為丁嘧脲分析值。
2）丁嘧脲在光和水中非常不穩定，試驗必須始終在避光條件下進行，嚴禁使用旋轉蒸發儀。此外，不需磨碎、切細的冷凍保存樣品解凍後，不能作為再度試驗的樣品。因磨碎樣品中經常加重丁嘧脲的分解，提取前直接進行均質。尿素體和甲烷亞氨基酰胺體的試驗溶液穩定。對於丁嘧脲的試驗溶液不穩定的作物，配製後保存在冷凍庫中，最好迅速測定。

附：丁嘧脲尿素體〔1－特丁基－3－（2,6－二異丙基－4－苯氧基苯基）尿素〕