1 適用範圍
本方法適用於肉和肉製品中四環素族抗生素殘留量的檢驗
2 原理概要
四環素族 (四環素 土黴素 金黴素) 抗生素具有很強的抑菌作用。 在接有特定微生物的平板培養基上放入牛津杯， 在牛津杯內加滿試樣溶液 培養後測量抑菌圈的大小。
3 主要儀器和試劑與培養基
3.1 試劑：
3.1.1 磷酸鹽緩衝液(pH4.5)
稱取磷酸二氫鉀 13.6g， 溶解於蒸餾水中， 定容到 1000mL， 高壓滅菌 115℃，30min 冷卻後置4℃ 冰箱內保存。
3.1.2 生理鹽水稱取氯化鈉8.5g溶解於1 000mL蒸餾水中， 高壓滅菌115℃ 30min。
3.1.3 鹽酸 0.1mol/L溶液
3.1.4 標準四環素原液： 精確稱取四環素 50mg， 用0.1mol/L 鹽酸1 mL 溶解， 用水定容到 1 000mL， 在 4℃ 冰箱中可保存一周。
3.2 培養基
3.2.1 菌種培養基
胰蛋白腖 10.0g
牛肉膏 5.0g
氯化鈉 2.5g
瓊脂 14.0- 16.0g
蒸餾水 1 000mL
將以上成分加熱溶解， 高壓滅菌 121℃ 15min 最終pH6.5± 0.1
3.2.2 檢定用培養基
胰蛋白腖 6.0g
牛肉膏 1.5g
酵母膏 3.0g
瓊脂 14.0 -16.0g
蒸餾水 1 000mL
將以上成分加熱溶解 高壓滅菌 121℃ 15min 最終pH5.8± 0.1
3.3 儀器
3.3.1 培養皿： 內徑90mm,底部平整光滑 ，具陶質蓋。
3.3.2 牛津杯： 內徑6 ±0.1mm ，外徑7.8 ±0.1mm 高度10± 0.1mm
3.3.3 遊標卡尺 ：測量抑菌圈直徑用
3.3.4 均質器
3.3.5 離心機
3.3.6 恒溫水浴
3.3.7 恒溫培養箱
3.3.8 電熱幹烤箱170 ±0.1℃
4 過程簡述
4.1 檢樣液的製備
稱取試樣10.0g 加入0.1mol/L磷酸緩衝液 20mL，小心攪勻放置60min 然後於均質器中均質 (3000- 6000r/min)1min， 經4 000r/min離心10min， 其上清液為檢樣液。
4.2 菌液和檢定用平板的製備
4.2.1 菌液的製備
菌種： 蠟樣芽孢杆菌 (Bac cereus ATCC 11778) 由衛生部藥品生物製品檢定所提供。
將菌種移種於盛有300mL菌種培養基的克氏瓶中， 於30℃ 培養箱中培養 7天。鏡檢芽孢數達到 85 %以上， 用生理鹽水 25mL 洗下菌苔， 置 65℃ 恒溫水浴中加熱30min， 離心(2000r/min)20min 棄去上清液 ，如此重複洗滌芽孢懸液三次。 再置於65℃ 恒溫水浴加熱 30min ，然後取生理鹽水50mL製成芽孢懸液。 置4℃ 冰箱中可保存一個月
4.2.2 蠟樣芽孢杆菌懸液用量的測定
在實際檢定前先試幾個平板， 即把不同濃度的芽孢懸液加入檢定用培養基中，使0.05ug/mL濃度的標準四環素溶液可產生 12mm以上的清晰 、完整的抑菌圈作為最適芽孢用量。 一般用量為每 100mL檢定用培養基內加芽孢懸液0.5- 1.0mL ，1.0mL菌懸液中含芽孢數約為 106
4.2.3 檢定用平板的製備
將適量芽孢懸液加入溶化後冷卻至 55- 60℃ 的檢定用培養基中混勻。 每個平皿內加入培養基6mL， 前後搖動平皿， 使含有芽孢的檢定培養基均勻覆蓋於平皿表麵，置水平位置上蓋上陶質蓋， 待凝固後， 於每個平板的培養表麵放置6個牛津杯， 使牛津杯在半徑為2.8cm的圓麵上成60度角的間距。所用平板須當天製備。
4.3 檢定
4.3.1 標準曲線的繪製
四環素稀釋液 取原液用 0.1mol/L磷酸鹽緩衝溶液稀釋成0.025、 0.050、 0.100、0.200、 0.400、 0.800u g/mL 的標準溶掖 (當天用當天稀釋)。
取檢定用平板18個 ，分成6組， 每組3個平板作為平行試驗。 第一組於每個平板的6個牛津杯中分別加滿 0.025u g/mL的標準溶液作為對照組。 第二到第六組於每個平板上的6個牛津杯中， 間隔加滿0.200u g/mL的標準溶液作為參考。 各組餘下的牛津杯， 根據組別順序依次加滿 0.050 、0.100 、0.200、0.400 、0.800 ug/mL的標準溶液 ，經培養後 ，以各組抑菌圈直徑的校正平均值繪製標準曲線。 抑菌圈直徑校正值 (mm) 等於2 -6組 (0.200ug/mL) 抑菌圈直徑的平均值減去各組抑菌圈直徑平均值。 用此校正值校正 0.050、 0.100 、0.200 、0.400 、0.800 ug/mL標準溶液的抑菌圈直徑平均值.。
校正後的值 ，包括 0.200ug/mL 濃度的平均值在半對數坐標紙上作圖, 以抑菌圈直徑為橫坐標 (算術級), 以濃度為縱坐標 (對數級) 通過下列公式繪出標準曲線
L = (3a +2b+ c- e)/5
H = (3e+ 2d+ c- a)/5
式中： L—標準曲線的最低濃度的抑菌圈直徑； a b e相應濃度是 0.050、 0.100、0.800u g/mL。
H —標準曲線的最高濃度的抑菌圈直徑； a d e相應濃度是 0.050、 0.400 、0.800ug/mL
c—參考濃度(0.200u g/mL)的 45個抑菌圈直徑的平均值。
4.3.2 試樣中四環素族抗生素殘留量的檢定
每份試樣取 3個檢定用平板， 在每個檢定用板上， 間隔的 3個牛津杯內加滿四環素標準參考濃度溶液。 另外3個牛津杯加滿被檢試樣液， 將陶質蓋重新蓋好， 置30 ±1℃ 培養箱中， 培養 17± 1h 除去牛津杯翻轉平板， 精確的測量產生的抑菌圈直徑 (精確到 0.1mm)。 分別求出 3個檢定用平板上參考濃度和被檢試樣抑菌圈直徑數值校正後，從四環素標準曲線上查出被檢試樣中四環素的含量。
5 結果計算
從標準曲線上查出被檢試樣液的抗生素殘留量， 乘以稀釋倍數， 結果以 mg/kg計算。
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