動物源性食品中四環素、沙星類殘留量的快速測定方法

一 範圍
    本方法規定了動物源性食品中四環素類、沙星類高效液相色譜的快速測定方法。 
    本方法適用於動物源性食品中四環素類、沙星類高效液相色譜的快速測定。

二 方法

    2.1  原理
    試樣中的殘留物經四環素類、沙星類快速檢測前處理試劑盒處理，樣液經四環素類專用層析柱淨化、濃縮用高效液相色譜檢測，外標法定量。
 
    2.2  試劑和材料
    除另有規定外，所有試劑均為分析純，水為重蒸餾水。
    2.2.1  乙腈：色譜純。
    2.2.2  甲醇：色譜純。 
    2.2.3  三乙胺（分析純）
    2.2.4  磷酸（85%）（分析純）
    2.2.5  磷酸氫二鈉:優級純。
    2.2.6  乙二胺四乙酸二鈉。
    2.2.7  檸檬酸：分析純。
    2.2.8  磷酸氫二鈉溶液:0.2mol/L。稱取28.41g磷酸氫二鈉,用水水溶解,定容至1000mL。
    2.2.9  檸檬酸酸溶液:0.1mol/L。稱取21.01g檸檬酸,用水溶解,定溶至1000mL。
    2.2.10  Mcllvaine緩衝溶液:將1000mL0.1mol/L檸檬酸溶液與625mL0.1mol/L磷酸氫二鈉溶液混合。
    2.2.11  Na2EDTA-Mcllvaine緩衝溶液:0.1mol/L。稱取60.5g乙二胺四乙酸二鈉放入1625mLMclllvaine緩衝溶液中,使其溶解,搖勻。
    2.2.12  標準品: 土黴素、四環素、金黴素、強力黴素、氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、單諾沙星、恩諾沙星純度大於98 %。
    2.2.13  標準貯備溶液:分別稱取土黴素、四環素、金黴素、強力黴素、氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、單諾沙星、恩諾沙星各10mg，用甲醇溶解並定溶於100 mL棕色容量瓶中，配製成100 µg/mL的標準貯備液，置於-20℃保存，有效期三個月。
    2.2.14  混合標準工作溶液:用流動相稀釋標準貯備溶液，配製成土黴素、四環素、金黴素、強力黴素、氧氟沙星、諾氟沙星、環丙沙星、單諾沙星、恩諾沙星均為10 µg/mL的混合標準溶液。0～4℃避光保存。
    2.2.15  四環素、沙星類快速檢測前處理試劑盒* ()。
    2.3  儀器和設備
    2.3.1  高效液相色譜儀：配紫外-可見光波長檢測器。
    2.3.2  勻漿機。
    2.3.3  固相萃取機
    2.3.4  離心機：4000 r/min。
    2.3.5  調速多用振蕩器。
    2.3.6  聚四氟乙烯離心管: 2.5 mL，50 mL，具塞。
    2 .4  樣品製備
準確稱取已搗碎的樣品5.00 g於50 mL離心管中,先加入四環素、沙星類快速檢測前處理試劑盒中的提取劑1*(液體20mL)，用調速多用振蕩器150 rpm振蕩3 min,，4000 r/min離心5 min，收集上清液；再加入提取劑2*(液體10ml) 用調速多用振蕩器150 rpm振蕩3 min,4000 r/min離心5 min，合並上清液；取一半上清液加入四環素專用層析柱中(使用前依次用5mL甲醇、5mL緩衝液（2.2.11）激活)擠幹，用0.80mL甲醇洗脫,收集洗脫液,用0.2mL乙酸銨緩衝液至1.0mL。供儀器測定。
    2.5 測定
    2.5.1  液相色譜條件
    a) 色譜柱:   C18柱，250 mm×4 mm(i.d.),粒度5µm;
    b) 流動相:  0.05 mol/L磷酸/三乙胺緩衝液（pH2.4）+乙腈(80+20,V/V);
    c) 流速:     1.0mL/min;
    d) 柱溫:     室溫;
    e) 檢測波長: 四環素類紫外檢測器360 nm。沙星類 紫外檢測器310nm；熒光檢測器激發波長280nm，發射波長450nm。
     f) 進樣量：50 uL。 
    2.5.2  標準工作曲線繪製
移取各移取四環素類、沙星類混和標準液，用流動相稀釋成20 ng/mL、50 ng/mL、250 ng/mL、500 ng/mL標準工作溶液。按液相色譜條件（3.5.1）進行測定，以色譜峰的峰麵積為縱坐標，與其對應的濃度為橫坐標作圖，繪製標準工作曲線，標準工作曲線範圍：20.0~500 ng/mL。  
    2.5.3 試樣測定
   用微量進樣器準確吸取試樣溶液（3.4），按液相色譜條件（3.5.1）進行測定，記錄色譜峰的保留時間和峰麵積。 
    2.6  結果計算
    按式（1）分別計算供試樣品中的四環素類、沙星類殘留量。 
                        
        ω=   2×ci×V/ m     　…… (1)
       ω－水產品中四環素、沙星類殘留量，ug/kg；
       ci －標準曲線上查出試樣溶液中四環素、沙星類標準工作溶液的濃度，（ug/L）；
       v－最終定容體積數，mL； 
       2－換算常數； 
       m－供試試料樣品重量，g。
     本方法分別計算四環素類、沙星類結果。 
     2.7  檢測限
     本方法土黴素、四環素檢測限為20ug/kg；金黴素、強力黴素的檢測限為50ug/kg，沙星類為：5ug/kg 
     2.8  回收率
     本方法土黴素、四環素、金黴素、強力黴素回收率為:75%～85%；沙星類回收率為：75%～85%