病毒含量較高的樣品浸出液或體液,可不經過病毒分離直接用於診斷鑒定。病毒含量較少的樣品,則需通過病毒的分離增殖來提高診斷的準確性和鑒定的可靠性。病毒分離首先要對樣品進行適當的處理,然後接種實驗動物或培養的組織細胞。
(一)組織器官樣品的處理
1、用無菌操作取一小塊樣品,充分剪碎,置乳缽中加玻璃砂研磨或用組織搗碎機製成勻漿,隨後加1-2ml Hank's平衡鹽溶液製成組織懸液,再加1-2ml繼續研磨,逐漸製成10%-20%的懸液;
2、加入複合抗生素;
3、以800×g離心15min;
4、取上清液用於病毒分離。必要時可用有機溶劑去除雜蛋白和進行濃縮(見下文)。
(二)糞便樣品的處理
1、加4g的糞便於16ml Hank's平衡鹽容液中製成20%的懸液;
2、於密閉的容器中強烈振蕩30min,如果可能則加入玻璃珠;
3、以6000×g低溫離心30min,取上清液再次重複離心;
4、用450nm的微孔濾膜過濾;
5、加二倍濃度的複合抗生素,然後直接用於病毒分離或進行必要的濃縮後再行病毒分離。
(三)無菌的體液(腹水、脊髓液、脫纖血液、水泡液等)和雞胚液樣品
可不做處理,直接用於病毒分離。
注:Hank's平衡鹽溶液和複合抗生素的配製見細胞培養溶液的配製。
(四)樣品的特殊除菌處理
樣品經過上述一般處理即可用於病毒分離,但對某些樣品用一般方法難以去除的汙染,則應考慮配合如下方法進行處理:
1、乙醚除菌 對有些病毒(如腸道病毒、鼻病毒、呼腸孤病毒、腺病毒、小RNA病毒等)對乙醚有抵抗力,可按冷乙醚:樣品=1:1(V:V)加入,懸液充分振蕩,置4℃過夜。取用下層水相分離病毒。
2、染料普魯黃(Proflavin)除菌 由於其對腸道病毒和鼻病毒很少或沒有影響,常用作糞或喉頭樣品中細菌的光動力滅活劑。將樣品用0.0001mol/L pH9.0的普魯黃於37℃作用60min,隨後用離子交換樹脂除去染料,將樣品暴露於白光下,即可使其中已經被光致敏的細菌或黴菌滅活。
3、過濾除菌 可用陶土濾器、瓷濾器、石棉濾器或者200nm孔徑的混合纖維素酯微孔濾膜等除菌,但對病毒有損失。
4. 離心除菌 用低溫高速離心機以1800r/min(15.24cm)離心20min,可沉澱除去細菌,而病毒(小於100nm)保持在清液中。必要時轉移離心管重複離心一次。
(五)待檢樣品中病毒的濃縮
對病毒含量很少的病毒樣品用一般普通方法不易檢測或分離出病毒,必須經過濃縮。常用濃縮方法如下:
1、聚乙二醇(PEG)濃縮法 將分子量6000的PEG逐步加入經一般處理的樣品溶液中,使終濃度為8%,置4℃過夜。以3000×g離心15min,用少量含複合抗生素的Hank's平衡鹽溶液重懸,必要時用450nm微孔濾器除去真菌孢子。
2、硫酸銨濃縮法 將等量飽和硫酸銨溶液緩慢加入經過上述一般處理的樣品溶液中,邊加邊攪拌,置4℃過夜。離心同上。
3、超濾器濃縮法 是一種高效率的濃縮法,特別適合大體積的樣品濃縮。
4、超速離心濃縮法 以40000r/min(15.24cm)離心60-120min,絕大多數病毒將沉於管底。用少量Hank's平衡鹽溶液懸浮病毒。這種方法回收效率很高,但僅適用於小體積的樣品。
(六) 病毒分離樣品脂類物質的去除
有些病毒樣品(如組織樣品)脂類和非病毒蛋白含量很高,必要時在濃縮病毒樣品之前可用有機溶劑抽提。常用的有機溶劑有正丁醇、三氯乙烯、氟裏昂等。方法是將預冷的等量有機溶劑加入樣品中,強烈振蕩後,1000×g離心5min,脂類和大量非病毒蛋白將保留在有機相中,病毒保留在水相中。應當注意的是,病毒必須對這些有機溶劑有抗性。
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