1範圍
SN / T 1933 的本部分規定了食品和水中腸球菌平板計數、最近似值測定的檢驗方法。本部分適用於生活用水、生產加工用水及食品中腸球菌的檢驗。
2 規範性引用文件
下列文件中的條款通過SN / T 1933 的本部分的引用而成為本部分的條款。凡是注日期的引用文件，其隨後所有的修改單（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用於本部分，然而，鼓勵根據本部分達成協議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用於本部分。
GB / T 6682 分析實驗室用水規格和實驗方法
SN / T 0330 出口食品中微生物學檢驗通則
3 術語、定義和縮略語
3 .1術語和定義
下列術語、定義和縮略語適用於SN / T 1933 的本部分。
腸球菌Enterococci
一類革蘭氏陽性球菌，兼性厭氧，無芽胞和莢膜，可分解膽汁七葉苷。是評估食品、水、食品加工設備、食品生產環境等衛生狀況的指標菌之一。
3 . 2 略縮語
3 . 2 . 1 BEA
膽汁七葉苷瓊脂。
3 . 2 . 2 BHIB
腦心浸液肉湯。
3 . 2 . 3 BHIA
腦心浸液瓊脂。
4 設備和材料
4.1電子天平：感量為0．001g 。
4.2恒溫水浴箱：46 ℃ 士1 ℃ 。
4.3恒溫培養箱：35℃士0.5℃，36℃士1℃，45℃ 士0.5℃，35℃士2℃ 。
4.4均質器。
4.5振蕩器。
4.6移液管：容量1mL,10mL。
4.7培養皿。
5 培養基和試劑
實驗用水符合GB / T 6682 分析實驗室用水規格和實驗方法的要求。除另有規定外，試劑為分析純。
5 . 1疊氮化鈉葡萄糖肉湯（見附錄第A.l章）。
5 . 2 腸球菌肉湯（見附錄第A . 2 章）。
5 . 3 KF 鏈球菌瓊脂（見附錄第A . 3 章）。
5 . 4 腸球菌瓊脂（膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂）（見附錄第A . 4 章）
5 . 5 膽汁七葉苷瓊脂（BEA 瓊脂）（見附錄第A . 5 章）
5 . 6 腦心浸液肉湯（見附錄第A . 6 章）。
5 . 7 含6 . 5 ％氯化鈉（NaCl）腦心浸液肉湯（見附錄第A . 7 章）。
5 . 8 腦心浸液瓊脂（見附錄第A . 8 章）。
5 . 9 緩衝蛋白腖水（見附錄第A．9 章）。
6 樣品製備
6 . 1抽樣數量及抽樣方法
抽樣數量及抽樣方法按SN / T 0330 進行。
6 . 2 樣品的貯存和運送
采樣後應盡快進行檢驗，冷凍樣品如不能立即進行檢驗，應置於-18 ℃ 保存。應冷藏保存的待檢樣品在運送實驗室過程中應於1 ℃ ~ -4 ℃ 保存。樣品采集後8h 之內要完成檢驗。
6 . 3製樣
6 . 3 .1水及液體飲料：汙染程度低的水及液體飲料可以直接進行檢驗；汙染程度嚴重的水及液體飲料吸取25 mL 樣品，加人225 mL 緩衝蛋白腖水中，充分混勻，製成1：10 樣品勻液。
6 . 3 . 2 固體或半固體食品：無菌操作取25g樣品放人裝有225 mL 緩衝蛋白腖水的均質杯內，以8000r/min均質1min~2 min ，製成1 : 10 樣品勻液。
6 . 3 . 3 以上樣品製備可根據樣品汙染程度及檢驗需要，進一步製成功倍遞增的樣品稀釋液。
7 檢驗程序
食品和水中腸球菌平板計數法檢驗程序見圖1 。
25g (mL) + 225 mL 緩衝蛋白腖水
↓
10 倍梯度稀釋
↓
選擇2 個~3 個適宜連續稀釋度，各取1 mL 分別加入滅菌培養皿
↙ ↘
KF瓊脂36℃ 士1℃ 48h 士2h 腸球菌瓊脂35℃士2℃ 24h士2h
↘ ↙
確證實驗
↓
腸球菌陽性
↓
菌落計數及計算
↓
報告結果
食品和水中腸球菌最近似值（MPN ）測定法檢驗程序見圖2 。
25g（mL ) + 225 mL 緩衝蛋白腖水
↓
10 倍梯度稀釋
↓
選擇3 個適宜連續稀釋度，各取1 ml 分別加入肉湯中
↙ ↘
疊氮化鈉葡萄糖肉湯管 腸球菌肉湯管
37℃ 士1℃ , 24h~48h 35C 士2 ℃ 24h 士2h
↓ ↓ ↓ ↓
無混濁 混濁 變黑 不變黑
↓ ↓ ↓ ↓
腸球菌陰性 確證實驗 確證實驗 腸球菌陰性
↓ ↓
腸球菌陽性 腸球菌陽性
↘ ↙
MPN 值法報告腸球菌數／g(mI)
圖2 食品和水中腸球菌最近似值（MPN）法的檢驗程序示意圖
8 檢驗步驟與計數
8 .1平板計數法
8 .1．1 適用範圍
此方法適用於檢驗未經加工處理的生鮮食品及腸球菌菌數大於10 CFU / g ( mL ）的水和食品。
8 . 1 . 2 培養基製備
製備KF 瓊脂培養基或腸球菌瓊脂（膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂）（參見第A . 3 章或第A . 4 章），傾注平板前將融化的培養基於46 ℃ 士1℃ 水浴保溫。
8 .1．3 接種和培養
8 . 1 . 3 . 1 根據樣品汙染情況，選擇2 個~ 3 個適宜連續稀釋度的樣液，分別吸取1mL 稀釋液，加人培養皿中，每個稀釋度做兩個平板。
8 .1．3 . 2 稀釋液加人培養皿後，把保持46℃士l℃的KF瓊脂或腸球菌瓊脂15ml傾人培養皿內，使樣液與培養基充分混合。水平放置，使瓊脂凝固。從製備最初稀釋液結束到傾注培養基於最後一個培養皿所用時間不應超過20min。倒置平板進行培養，KF平板置36℃士l℃培養銘48h 士2h；腸球菌瓊脂平板置35 ℃士2℃培養24h士2h 。
8 .1．4 菌落形態觀察
腸球菌屬細菌在KF 平板上形成暗紅至粉紅色菌落，邊緣整齊；在腸球菌瓊脂平板上形成帶棕色環的棕黑色菌落。用滅菌接種針從每個KF 平板或腸球菌瓊脂平板挑取10個典型菌落，進一步做確證實驗。
8 .1．5 確證實驗
典型菌落分別接種到BHIB 肉湯和BHIA 斜麵，BHIB 肉湯置35℃士0．5℃ 培養24h 士2h , BHIA 斜麵置35℃士0 . 5℃ 培養48h士2h 。
8 .1．5 . 1 BHIB 肉湯培養24h 後，每管肉湯培養物分別接種到相應BEA 平板、BHIB 肉湯及含6 . 5 %氯化鈉（NaCI）的BHIB 肉湯中。BEA 平板及含6 . 5 ％氯化鈉（NaCI）的BHIB 肉湯置35℃士0 . 5℃ 培養48h 士2h ; BHIB 肉湯置45 ℃ 士0 . 5 ℃ 培養48h 士2h ，觀察細菌生長情況。
8 .1．5 . 2 BHIA 斜麵培養48h 後，從斜麵上挑取菌落作革蘭氏染色。
8 . 1 . 5 . 3 革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陽性球菌；在BEA 平板上生長並水解七葉苷（形成黑色或棕色沉澱）; BHIB 肉湯中45 ℃ 士0．5 ℃ 生長；並且在含6 . 5 ％氯化鈉（NaCI）的BHIB 肉湯中35℃士0 . 5℃生長良好；具有以上特性的典型菌落可確證為腸球菌。
8 .1．6 菌落計數
對確證為腸球菌的菌落進行平板計數，生長有30 個~300 個腸球菌為計數合適範圍。
8.1．7 結果計算
8 . 1 . 7 . 1 用所選擇計數的每個平板上典型腸球菌的菌落數，乘以確認為腸球菌的菌落所占比例，以此求出所選取的同一稀釋度兩個計數平板的腸球菌菌落數。
示例：10-1稀釋樣液的兩個平板上分別有85 個和90 個菌落，每個平板所挑取的功個典型菌落中，確認為腸球菌的分別有8 個和9 個，則此稀釋度的兩個計數平板上腸球菌菌落數分別是85 x（8 / 10 ）=68 及90x（9 / 10 ）=81 。
8 .1．7 . 2 若隻有一個稀釋度平板上的腸球菌菌落數在計數合適範圍30 個~300 個之間，則計算兩個平板菌落數的平均值，再將平均值除以相應稀釋倍數，作為每克（毫升）中菌落總數結果。
8.1．7 . 3 若有兩個連續稀釋度在適宜計數範圍內時，按式(1)計算：
N=∑C/[(n1+0.1n2)d]………………………………………………… （l)
式中：
N ― 樣品中腸球菌菌落數；
∑C ― 兩個連續稀釋度平板（含適宜範圍菌落數的平板）腸球菌菌落數之和
n1 ― 適宜範圍菌落數的第一稀釋度（低）平板個數；
n2 ― 適宜範圍菌落數的第二稀釋度（高）平板個數；
d ― 第一稀釋度的稀釋倍數。
示例：
|
稀釋度 |
1:10（第一稀釋度） |
1:100（第二稀釋度） |
|
菌落數 |
245,247 |
31,30 |
N=∑C/[(n1+0.1n2)d] =( 245 + 247 + 31 + 30 )/[(2 + 0.1x2）x10-1]=2514
上述數據經修約後，結果表述為2 .5x103 CFU/g(mL）。
8 . 1 . 7 . 4 若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無特征性菌落生長，則以小於l/d(d一最低稀釋倍數）計算。
8 . 1 . 7 . 5 低數值的估算：如果實驗樣品原液（水及液體飲料）或初始稀釋懸液（其他食品）的兩個瓊脂平板上的菌落數均小於30 個，計算兩個瓊脂平板上菌落數的算術平均數。計算方法見式（2 ) :
NE=∑C /nd…………………………………( 2 )
式中：
NE ― 每毫升或每克樣品中腸球菌數的估算值；
∑C ― 兩個瓊脂平板上腸球菌菌落數的和；
n― 瓊脂平板的數量；
d ― 樣品初始懸液或實際接種懸液的稀釋倍數。
8 . 1 . 7 . 6 大數值的估算：若所有稀釋度的平板上菌落數均大於300 ，計數最接近300 個菌落數的瓊脂平板上的菌落並計算出算術平均數。其他平板可記錄為多不可計。
結果計算見式（3 ) :
NF=∑C /nd……………………………………………… （3 )
式中：
NF ― 每毫升或每克樣品中腸球菌菌落數的估計值；
∑C ― 兩個瓊脂平板上腸球菌菌落數之和；
n― 瓊脂平板的數量；
d ― 與樣品懸液相一致的稀釋倍數。
8 . 1 . 8 結果表述方式
8 .1．8 . 1 菌落數在100 以內時，按有效數字修約規則修約，采用兩位有效數字報告。
8 .1．8 . 2 菌落數大於或等於100 時，前第3 位數字采用有效數字修約規則修約後，取前2 位數字，後麵用。代替位數來表示結果；也可用10 的指數形式來表示，此時也按有效數字修約規則修約，采用兩位有效數字。
8 . 1 . 9 結果報告
固體樣品以CFU/g為單位報告，液體樣品以CFU/ml才為單位報告。
8 . 2 最近似值（MPN）測定法
8 . 2 . 1 適用範圍
此方法適用於汙染程度低的樣品，檢驗含有受損傷的腸球菌的加工食品及腸球菌菌數小於等於10 CFU/g(ml）的水和食品。
8 . 2 . 2 接種
根據樣品汙染情況，選擇3 個適宜連續稀釋度的樣液，分別吸取1 mL 稀釋液，接種於疊氮化鈉葡萄糖肉湯或腸球菌肉湯，每個稀釋度加3 管。接種量為1 ml 時，使用功ml單料管；對於低汙染樣品，將10 mL最低稀釋度的樣品液加到等體積的雙料培養基中。
8 . 2 . 3 培養
接種後的腸球菌肉湯置35℃士2℃ 培養24h 士2h ，肉湯顏色變為黑色的試管，表明有腸球菌生長。一般有腸球菌生長時，肉湯顏色在2h 內即可變為黑色。
接種後的疊氮化鈉葡萄糖肉湯置36℃士1℃ 培養24h士2h，檢查各試管混濁情況。若無混濁，繼續培養至48h 士2h 後記錄結果。
8 . 2 . 4 確證試驗
8 . 2 . 4 . 1 對所有呈現混濁的疊氮化鈉葡萄糖肉湯管或顏色變為黑色的腸球菌肉湯管進行確證試驗。用接種環將各管的培養物劃線接種於KF 平板或腸球菌瓊脂平板。KF 平板置36℃士1℃ 培養48h士2h；腸球菌瓊脂平板置35℃士2 ℃ 培養24h 士2h 。
8 . 2 . 4 . 2 腸球菌屬細菌在KF 平板上形成暗紅至粉紅色菌落，邊緣整齊；在腸球菌瓊脂平板上形成帶棕色環的棕黑色菌落。用滅菌接種針從KF 平板或腸球菌瓊脂平板挑取10 個可疑菌落，按8 . 1 . 5 所述進行確證試驗。
8 . 2 . 5 最近似值MPN
8 . 2 . 5 . 1 如一管培養物中所挑取的典型菌落中，有一個菌落確認為腸球菌，則該管應視為陽性。
8 . 2 . 5 . 2 根據接種的樣品量和確證為腸球菌的陽性反應管數，查MPN 值表（參見附錄B) ，得出樣品中腸球菌最近似值。
8 . 2 . 6 結果報告
腸球菌MPN/g(mL）。
附錄A （資料性附錄）培養基
A . 1 疊氮化鈉葡萄糖肉湯
A . 1 . 1 成分
牛肉浸膏 4.5g
胰蛋白脈15.0g
葡萄糖7.5g
氯化鈉7.5g
疊氮化鈉0.2g
蒸餾水1000.0mL
A . 1 . 2 製法
將上述各成分混勻，不斷攪拌加熱溶解。每管分裝10 mL , 121 ℃ 高壓滅菌15 min，調節pH至7.2。若製備雙料濃度的疊氮化鈉葡萄糖肉湯，可將上述配方蒸餾水改為500ml。
A . 2 腸球菌肉湯
A . 2 . 1成分
胰蛋白腖17.0g
牛肉浸膏3.0g
酵母浸膏5.0g
牛膽粉10.0g
氯化鈉5.0g
檸檬酸鈉1.0g
七葉苷1.0g
檸檬酸鐵銨0.5g
疊氮化鈉0.25g
蒸餾水1000.0ml
2 製法
將上述各成分加熱煮沸溶解冷卻後，調pH至7.1 士0.2，分裝，121℃高壓滅菌15min，備用。
A . 3 KF 鏈球菌瓊脂
A . 3 . 1 成分蛋白脈酵母浸膏氯化鈉甘油磷酸鈉麥芽糖乳糖瓊脂
蛋白腖 10.0g
酵母浸膏10.0g
氯化鈉 5.0g
甘油磷酸鈉10.0g
麥芽糖20.0g
乳糖1.0g
疊氮化鈉0.4g
瓊脂20.0g
蒸餾水1000.0ml
A . 3 . 2 製法
將各成分加熱溶解，用10％的碳酸鈉調整pH 值至7.2,121℃高壓滅菌15 min ，冷卻至50℃ ~ 60℃時加人無菌1 ％氯化三苯四氮唑水溶液10 mL 。
A . 4 腸球菌瓊脂（膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂）
A . 4 . 1 成分
胰蛋白腖17.0g
牛肉浸膏3.0g
酵母浸膏5.0g
牛膽粉10.0g
氯化鈉5.0g
檸檬酸鈉1.0g
七葉苷1.0g
檸檬酸鐵銨0.5g
疊氮化鈉0.25g
瓊脂13.5g
蒸餾水1000.0ml
A . 4 . 2 製法
121 ℃ 高壓滅菌15 min ，滅菌後調節pH 至7 . 1 ，於45℃ ~50 ℃ 保溫培養基，從保溫開始至傾注平板的時間不要超過4h 。
A . 5 膽汁七葉苷瓊脂
A . 5 . 1 成分
蛋白腖8.0g
膽鹽20.0g
檸檬酸鐵0.5g
七葉苷1.0g
瓊脂15.0g
蒸餾水1000.0ml
A . 5 . 2 製法
將各成分加熱溶解, 121 ℃ 高壓滅菌15 min ，調節pH 至7 . 1 士0 . 2 。冷至45 ℃~50 ℃ 傾注平板。
A . 6 腦心浸液肉湯（BHIB)
A . 6 . 1 成分
牛腦浸出粉10.0g
牛心浸出粉9.0g
胰蛋白腖10.0g
葡萄糖2.0g
氯化鈉5.0g
磷酸氫二鈉2.5g
A . 6 . 2 製法
將各成分加人蒸餾水中，加熱溶解，調節pH 至7.4士0 .2，分裝，121℃高壓滅菌15min。
A . 7 含6.5 ％氯化鈉（NaCl）腦心浸液肉湯
A . 7 . 1 成分
除加人氯化鈉（NaCl)，其餘成分與BHIB相同。
A . 7 . 2 製法
每升BHIB中加60.0g 氯化鈉（NaCl) ，其餘製法與BHIB 相同。
A . 8 腦心浸液瓊脂
A . 8 . 1 成分
除每升BHIB 加15.0g瓊脂，其餘成分與BHIB 相同。
A . 8 . 2 製法
稱取52g 無水BHIA 溶於1 000 mL 蒸餾水中，加熱溶解，每管分裝10mL ,121℃高壓滅菌15min，製備成斜麵，調節pH至7.4士0.2 。
A . 9 緩衝蛋白腖水
A . 9 . 1 成分
蛋白腖10.0g
氯化鈉5.0g
磷酸氫二鈉9.0g
磷酸二氫鉀1.5g
蒸餾水1000.0ml
A . 9 . 2 製法
按上述成分配好後，調節pH 至7.2 ，每瓶分裝225ml , 121℃ 高壓滅菌15min 。
附錄B
（規範性附錄）
1g樣品中最近似值（MPN ）表
表B .1 1.0g品中最近似值（MPN）表
|
陽性管數／（g/mL ) |
MPN |
陽性管數／(g/mL ) |
MPN |
|
0.1 0.01 0.001 |
0.1 0.01 0.001 |
|
0 0 0
0 0 1
0 0 2
0 0 3
0 1 0
0 1 1
0 1 2
0 1 3
0 2 0
0 2 1
0 2 2
0 2 3
0 3 0
0 3 1
0 3 2
0 3 3 |
<3
3
6
9
3
6.1
9.2
12
6.2
9.3
12
16
9.4
13
16
19 |
2 0 0
2 0 1
2 0 2
2 0 3
2 1 0
2 1 1
2 1 2
2 1 3
2 2 0
2 2 1
2 2 2
2 2 3
2 3 0
2 3 1
2 3 2
2 3 3 |
9.1
14
20
26
15
20
27
34
21
28
35
42
29
36
44
53 |
|
1 0 0
1 0 1
1 0 2
1 0 3
1 1 0
1 1 1
1 1 2
1 1 3
1 2 0
1 2 1
1 2 2
1 2 3
1 3 0
1 3 1
1 3 2
1 3 3 |
3.6
7.2
11
15
7.3
11
15
19
11
15
20
24
16
20
24
29 |
3 0 0
3 0 1
3 0 2
3 0 3
3 1 0
3 1 1
3 1 2
3 1 3
3 2 0
3 2 1
3 2 2
3 2 3
3 3 0
3 3 1
3 3 2
3 3 3 |
23
39
64
95
43
75
120
160
93
150
230
290
240
640
1100
>1100 |
|
注：表內所列樣品量如改為1g（ml）,0.1g(ml),0.01g(ml)時，表內數字應相應降低10倍；如改為0.01g（ml）,0.001g(ml)0.0001g(ml)時，則表內數字相應增加10倍，其餘可類推。 |
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