1範圍
SN /T 1933 的本部分規定了水和液體飲料中腸球菌檢驗濾膜法。
本部分適用於生活用水、生產加工用水、廢水及茶飲料、碳酸飲料等液體飲料中腸球菌的檢驗。
2 規範性引用文件
下列文件中的條款通過SN / T 1933 的本部分的引用而成為本部分的條款。凡是注日期的引用文件，其隨後所有的修改單（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用於本部分，然而，鼓勵根據本部分達成協議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用於本部分。
GB / T 6682 分析實驗室用水規格和實驗方法
SN / T 0330出口食品中微生物學檢驗通則
3 方法提要
一定數量液體樣品或樣品稀釋液通過濾膜時，細菌被截留在濾膜上。將濾膜置於選擇性培養基上培養後，腸球菌菌落呈現特定顏色。經過腸球菌菌落確證實驗後，計數並計算濾膜上陽性腸球菌菌落數，即可檢驗出樣品中腸球菌數目。
4 術語、定義和縮略語
SN / T 1933 . 1 確立的術語、定義和縮略語適用於SN / T 1933 的本部分。
5 設備和材料
5 .1電子天平：感量為0.001g 。
5 . 2 恒溫培養箱：41℃士0 .5℃，35℃士0.5℃，45℃士0.5℃
5 . 3 振蕩器。
5 . 4 移液管：容量1mL ,10mL 。
5 . 5 培養皿：9x50 mm ，直徑90 mm 。
5 . 6 玻璃、耐高溫塑料、陶瓷或不鏽鋼過濾器。
5 . 7 抽濾瓶。
5 . 8 真空泵。
5 . 9 濾膜：直徑47mm ，微孔徑0.45um 士0.02um 。
6 培養基和試劑
實驗用水符合GB / T 6682 分析實驗室用水規格和實驗方法的要求。除另有規定外，試劑為分析純。
6.1 mEI 瓊脂（見第A . l 章）。
6 . 2 膽汁七葉苷瓊脂（BEA 瓊脂）（見第A . 2 章）。
6 . 3腦心浸液肉湯（見第A . 3 章）。
6 . 4含6 . 5 % NaCl 腦心浸液肉湯（見第A . 4 章）。
6 . 5腦心浸液瓊脂（見第A . 5 章）。
6 . 6緩衝蛋白腖水（見第A . 6 章）。
7 樣品製備
7 .1抽樣數量及抽樣方法
抽樣數量及抽樣方法按SN / T 0330 進行。
7 . 2 樣品的貯存和運送
采樣後應盡快進行檢驗，冷凍樣品如不能立即進行檢驗，應置於-18 ℃ 保存。應冷藏保存的待檢樣品在運送實驗室過程中應於l ℃ ~ 4 ℃ 保存。樣品采集後8h 之內要完成檢驗。
7 . 3 製樣
7 . 3 . 1 汙染程度低的水及液體飲料可以直接進行檢驗。
7 . 3 . 2 汙染嚴重的水及液體飲料可吸取25 mL 樣品，加人225 mL 緩衝蛋白腖水中，充分混勻，製成l：10樣品勻液。
7 . 3 . 3 以上樣品製備可根據樣品汙染程度及檢驗需要，進一步製成10 倍遞增的樣品稀釋液。
8 檢驗程序
水和液體飲料中腸球菌濾膜法檢驗程序見圖l 。
樣品原液或適當倍數稀釋液
↓
樣品過濾
↓
mEl 瓊脂4l℃ 士0.5℃ 24h 士lh
↓
取帶藍色暈輪的菌落進行確證實驗
↙ ↙ ↘ ↘
革蘭氏陽性球菌 BEA平板生長， 在BHIB中45℃生長 6.5%NaCl的BHIB
水解七葉苷 中35℃ 生長
↓
腸球菌陽性
↓
菌落計數及計算
↓
報告結果
圖1 食品和水中腸球菌濾膜法的檢驗程序示意圖
9 檢驗步驟與計數
9 .1培養基平板製備
製備mEI 瓊脂培養基（見第A . 1 章）。
9 . 2 樣品量的選擇
根據樣品汙染情況，選擇適宜稀釋度的樣液。樣品加樣量在1mL ~100 mL 之間按半對數間距選擇（例如：加樣100ml 、30ml、10ml、3ml)，以能在濾膜上生長出20 個~60 個菌落為宜。每個樣品至少選擇三個加樣量進行過濾。
9 . 3 樣品過濾
將滅過菌的過濾裝置連接到抽濾瓶上，用無菌鑷子夾取濾膜，將濾膜放至濾器底部。無菌吸取樣液至濾器內，打開真空泵進行抽濾。當全部樣液通過濾膜後，用20mL~30ml滅菌生理鹽水輕洗濾器邊緣至少兩次。關閉真空泵，打開濾器，用無菌鑷子移取濾膜。
9 . 4 接種與培養
將已濾過樣液的濾膜緊貼在mEI瓊脂表麵上，防止濾膜與瓊脂間產生氣泡，如有氣泡產生，重新放置濾膜。倒置平板於41℃ 士0.5℃ 培養24h 士lh 。
9 . 5 菌落形態觀察
腸球菌在mEI 瓊脂平板的濾膜上形成帶有藍色暈輪的菌落。
9 . 6 確證試驗
9 . 6 . 1 用滅菌接種針從濾膜上至少挑取10 個帶有藍色暈輪的菌落（不必考慮菌落本身顏色，隻要是帶有藍色暈輪的菌落即可）進行確證試驗。菌落分別接種到BHIB 肉湯和BHIA 斜麵，BHIB 肉湯置35℃士0.5℃ 培養24h士lh , BHIA 斜麵置35℃士0.5℃ 培養48h士lh 。
9 . 6 . 2 BHIB 肉湯培養24h士lh 後，每管肉湯培養物分別接種到相應BEA 平板、BHIB 肉湯及含6.5％氯化鈉的BHIB 肉湯中。BEA 平板及含6.5％氯化鈉的BHIB 肉湯置35℃士0. 5℃培養48h士lh ; BHIB 肉湯置45℃士0.5℃培養48h士lh，觀察細菌生長情況。
9 . 6 . 3 BHIA 斜麵培養48h士lh後，從斜麵上挑取菌落作革蘭氏染色。
9 . 6 . 4 革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陽性球菌；在BEA 平板上生長並水解七葉苷（形成黑色或棕色沉澱）; BHIB 肉湯中45 ℃ 士0.5 ℃ 生長；並且在含6 . 5 ％氯化鈉的BHIB 肉湯中35℃ 士0．5℃生長良好；具有以上特性的典型菌落可確證為腸球菌。
9 . 7 腸球菌的計數
對確證為腸球菌菌落的濾膜進行計數，生長有20 個~60 個腸球菌的濾膜為計數合適範圍。
9 . 8 腸球菌菌數的計算
根據所使用的樣品量，按照式（1)，計算每100 mL 樣品中腸球菌菌落數。
腸球菌／100 ml =腸球菌菌落數x100 /[樣品過濾體積（mL）x稀釋倍數]
10 結果報告
腸球菌：CFU/100ml 。
附錄A
（資料性附錄）
培養基
A . 1 mEI 瓊脂
A . 1 . 1 成分
蛋白腖10.0g
氯化鈉15.0g
七葉苷1.0g
放線菌酮0.05g
疊氮化鈉0.15g
酵母浸膏30.0g
β-D- 引哚葡糖苷0.75g
瓊脂15.0g
蒸餾水100O.0ml
A . 1 . 2 製法
將以上各成分加熱溶解，121 ℃ 高壓滅菌15min ，在50 ℃ 水浴中冷卻。在5 ml蒸餾水中加0.24g萘啶酮酸，滴加幾滴0 .1 mol/L的氫氧化鈉，配製萘啶酮酸溶液，將此溶液加人mEI瓊脂中。再加人0 . 02g無菌氯化三苯四氮唑（TTC ) ，充分混勻。調節pH 值至7.1 士0.2 。
傾注約4 mL~6mL的mEI瓊脂至9x50 mm 的平板，瓊脂厚度約4mm ~5mm。平板冷藏備用。
A . 2 膽汁七葉苷瓊脂
A . 2 . 1 成分
蛋白腖8.0g
膽汁鹽20.0g
檸檬酸鐵0.5g
七葉苷1.0g
瓊脂15.0g
蒸餾水1000.0ml
A . 2 . 2 製法
將各成分加熱溶解, 121 ℃ 高壓滅菌15 min ，調節pH 值至7 . 1 士0 . 2 。冷至45℃~50 ℃ 傾注平板。
A . 3 腦心浸液肉湯（BHIB )
A . 3 . 1 成分
牛腦浸出粉10.0g
牛心浸出粉9 .0g
胰蛋白腖10.0g
葡萄糖2 .0g
氯化鈉5 . 0g
磷酸氫二鈉2 . 5g
蒸餾水1000.0ml
A . 3 . 2 製法
將各成分加人蒸餾水中，加熱溶解，調節pH 至7 . 4 士0 . 2 ，分裝，121 ℃ 高壓滅菌15 min 。
A . 4 含6 . 5 ％氯化鈉（NaCl）腦心浸液肉湯
A . 4 . 1 成分
除加人氯化鈉（NaCl) ，其餘成分與BHIB 肉湯相同。
A . 4 . 2 製法
每升BHIB 肉湯中加60.0g 氯化鈉（NaCl)，其餘製法與BHIB 肉湯相同。
A . 5 腦心浸液瓊脂
A . 5 . 1 成分
除每升BHIB 肉湯加15 .0g 瓊脂，其餘成分與BHIB 肉湯相同。
A . 5 . 2 製法
稱取52g BHIA 溶於1000 mL 蒸餾水中，加熱溶解，每管分裝10 mL , 121 ℃ 高壓滅菌15min ，製備成斜麵，調節pH 至7.4士0.2 。
A . 6 緩衝蛋白腖水
A . 6 . 1 成分
蛋白腖10 . 0g
氯化鈉5 . 0g
磷酸氫二鈉9 . 0g
磷酸二氫鉀1 . 5g
蒸餾水1000.0ml
A . 6 .2 製法
按上述成分配好後，調節pH 至7.2，每瓶分裝225 ml , 121 ℃ 高壓滅菌15min 。
上一篇：膨化食品衛生標準
下一篇：食品和水中腸球菌檢驗方法第1 部分：平板計數法和最近似值測定法
