農業部於 2003 年 1 月 22 日發布第 236 號公告，發布12 個動物性食品中獸藥殘留檢測方法。方法之十二：動物性食品中青黴素類抗生素殘留檢測方法———微生物法。
1 範 圍
本標準規定了動物性食品中青黴素類抗生素殘留的微生物學檢測方法。
本標準適用於牛奶中青黴素類抗生素的殘留篩選檢測。
2 規範性引用文件
下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨後所有的修改單(不包括勘誤的內容)或修訂版均不適用於本標準，然而，鼓勵根據本標準達成協議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用於本標準。
GB/ T1. 1 - 20001標準化工作導則第 1 部分：標準的結構和編寫規則( ISO/ IEC Directives , Part3 , 1997 , Rules for the st ructure and draf ting of In2ternational Standards , NEQ)
中華人民共和國獸藥典二○○○年版
GB/ T 6682 - 1992分析實驗室用水規則和試驗方法
N Y/ T ××××- 2001動物源食品中獸藥殘留檢測方法標準編寫規則
農牧發[1999 ]17號動物性食品中獸藥最高殘留限量
3 製 樣
3. 1 樣品的製備 取適量冷凍的空白或供試牛奶，於 30 ℃水浴中解凍。
3. 2 樣品的保存 - 20 ℃以下冰箱中貯存備用。
4 測定方法
4. 1 方法提要或原理 試料中殘留的青黴素類抗生素，以嗜熱脂肪芽孢杆菌為檢定菌，采用微生物學圓紙片篩選法定性測定。當檢定菌生長時，由於產酸而使培養基的顏色由紫色變為黃色。細菌被抑製的區域，無酸產生，培養基仍為紫色。本試驗用青黴素酶區分耐青黴素酶的抗生素和不耐青黴素酶的青黴素類抗生素。
4. 2 試劑和材料 以下所用試劑，除特別注明者外，均為分析純試劑，水為符合《中華人民共和國獸藥典》二○○○年版規定的純化水。
4. 2. 1 青黴素標準品
4. 2. 2 嗜熱脂肪芽孢杆菌 ( Baci l l us sterothermophi l us) ATCC 10149 經斜麵培養基(見附錄 A.1)每月傳代一次 ,置 2～8 ℃冰箱中保存。
4. 2. 3 青黴素酶 不得少於 200 萬單位/ mL
4. 2. 4 磷酸氫二鉀
4. 2. 5 磷酸二氫鉀
4. 2. 6 腖 生化試劑
4. 2. 7 大豆蛋白腖 生化試劑
4. 2. 8 胰蛋白腖 生化試劑
4. 2. 9 牛肉浸出膏 生化試劑
4. 2. 10 葡萄糖
4. 2. 11 氯化鈉
4. 2. 12 吐溫 – 80
4. 2. 13 溴甲酚紫
4. 2. 14 瓊脂 生化試劑
4. 2. 15 菌懸液的製備 將菌種接種至斜麵培養基上，置(55 ±2) ℃培養 24 h 後，接種到繁殖培養基(見附錄A. 2) 150 mL 中，於(55 ±2) ℃培養72 h ,當有80 %芽孢形成時，停止培養。培養液5 000 r/ min離心 15 min ,棄上清液;將沉澱物懸浮於滅菌生理鹽水中，振搖，離心，棄上清液，重複洗滌3 次。將洗滌過的芽孢懸浮於滅菌生理鹽水20 mL中，置2～8℃冰箱保存，可使用6個月。
將菌種接種至斜麵培養基上，置(55 ±2) ℃培養7 d後，鏡檢，應有芽孢85 %以上。用滅菌生理鹽水7 mL將芽孢洗下，在(65 ±2)℃加熱30 min ,備用。置 2～8 ℃冰箱保存 ,可使用 3 個月。
4. 2. 16 青黴素標準儲備液 取青黴素標準品適量，精密稱定，用磷酸鹽緩衝液 (pH 8. 0) 製成1 000μg/ mL的標準儲備液。置2～8℃冰箱保存，有效期3 d。
4. 2. 17 磷酸鹽緩衝液(pH 8. 0) 取磷酸二氫鉀2g與磷酸氫二鉀8g，加水使溶解成1 000 mL，濾過，分裝，115℃滅菌30 min。
4. 3 儀器與設備
4. 3. 1 圓濾紙片 直徑13 mm
4. 3. 2 平底雙碟 直徑約90 mm ,高16～17 mm
4. 3. 3 遊標卡尺(精度0. 02 mm)或抑菌圈測定儀
4. 3. 4 恒溫培養箱
4. 3. 5 微量移液器
4. 3. 6 顯微鏡
4. 3. 7 鑷子
4. 3. 8 電熱恒溫水浴鍋
4. 3. 9 分析天平 感量 0. 000 01 g
4. 3. 10 天平 感量 0. 01 g
4. 4 測定步驟
4. 4. 1 試料的製備 試料的製備包括:
———取供試樣品，作為供試試料。
———取空白樣品，作為空白試料。
———取空白樣品，將青黴素標準儲備液稀釋成10 ng/ mL 的溶液，作為空白添加試料。
———取供試樣品適量，按每1mL計加青黴素酶0. 10 mL ,在(37 ±2)℃培養30 min ,作為判定試驗試料。
4. 4. 2 樣品處理 取試料適量，(82 ±2)℃水浴加熱 2 min ,冷卻後，作為試樣溶液，供微生物法測定。
4. 4. 3 雙碟的製備 將檢定培養基(見附錄 A. 3)融化 ,置水浴中冷卻至 55～64 ℃,加入菌懸液(每100 mL培養基加0. 6～0. 8 mL )，搖勻，吸取6. 0 mL置平皿中，使其均勻攤布，待凝固15 min後備用。
4. 4. 4 測定 每個雙碟中放置5 個圓濾紙片，每個濾紙片間距 10 mm 以上 ,用鑷子輕壓紙片，使紙片與培養基緊密接觸，用微量移液器分別在5個濾紙片上加空白添加試料、空白試料、磷酸鹽緩衝液(pH8. 0)、判定試驗試料、供試試料各90μL。每個試料至少重複2個雙碟，置(55 ±2)℃培養箱中培養5～6 h。
4. 5 結果判定 供試試料中無抑菌圈，為陰性反應。供試試料中有大於空白添加試料的抑菌圈，但在判定試驗試料中無抑菌圈，為含不耐青黴素酶的青黴素類抗生素殘留的陽性反應。判定試驗試料和供試試料中有同等大小抑菌圈，為含其他抑菌物、不含不耐青黴素酶的青黴素類抗生素殘留的陽性反應。供試試料中有抑菌圈，但判定試驗試料中的抑菌圈遠小於供試試料中的抑菌圈，為既含其他抑菌物又含不耐青黴素酶的青黴素類抗生素殘留的陽性
反應。
5 檢測方法靈敏度
本方法在牛奶中的檢測限為 4μg/ kg。
附錄 A(規範性附錄) 培養基的配製
A. 1 斜麵瓊脂培養基
腖5 g ,酵母浸膏2 g ,牛肉浸膏1 g ,氯化鈉5 g ,瓊脂15 g ,水1 000 mL。除瓊脂外，混合上述成分，調節 pH值使其比最終的pH值略高 0. 2～0. 4 ,加入瓊脂 ,加熱溶化後濾過，調節pH 值使滅菌後為7. 4 ±0. 1，分裝，115℃滅菌 30 min ,趁熱斜放使凝固成斜麵。
A. 2 繁殖培養基
酵母浸膏 1 g ,胰蛋白腖 2 g ,葡萄糖0. 05 g ,水100 mL。混合上述成分，調節pH值使滅菌後為7. 2 ±0. 2 ,分裝 ,115℃滅菌30 min。
A. 3 檢定培養基
牛肉浸膏3 g ,蛋白腖5 g，胰蛋白腖1. 7 g，大豆蛋白腖 0. 3 g ，葡萄糖 5. 25 g，氯化鈉 0. 5 g，磷酸氫二鉀 0. 25 g，吐溫 - 80 1 g，溴甲酚紫0. 06 g，瓊脂15 g，水 1 000 mL。混合上述成分，調節pH值使滅菌後為7. 8 ±0. 2 ,分裝 ,115℃滅菌15 min。
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