六、蛋白質基本操作技術
（1）將幹淨的膠板裝好，用瓊脂糖膠（至少1％濃度）封邊。
（2）配分離膠，配方如下：（1.5mm厚的膠需要10ml）
10%分離膠（5ml）：去離子水1.25ml，30%丙烯酰胺1.7ml，1M This-HCl（pH=8.8）1.95ml，10% SDS 50ul，10%過硫酸胺100ul，TEMED 2ul。（倒膠前才加入TEMED催化劑）
（3）用去離子水密封液麵，左右輕輕搖擺使液麵水平（聚丙烯酰胺的聚合不能接觸氧氣，所以用水封液麵，水還能使聚丙烯酰胺的上液麵保持平整。）
（4）室溫聚合或放溫箱中加速聚合，傾斜膠板吸出水，倒濃縮膠（1.5mm厚的膠需要3ml）。濃縮膠配方如下：
濃縮膠1ml：去離子水0.68ml，1M This-HCl（pH=6.8）0.13ml，30%丙烯酰胺0.17ml，10% SDS 10ul，10%過硫酸胺10ul，TEMED 1ul。（倒膠前才加入TEMED催化劑）
（5）插上梳子，等膠凝固後，拔掉梳子，如果膠孔裏有很多氣泡，需要用濾紙剪成小條吸去氣泡。
（6）加入電泳緩衝液點樣電泳，蛋白在濃縮膠時可以用150V電壓，在分離膠時可以用250V電壓，注意觀察蛋白的濃縮效果，如果濃縮效果不好說明電泳緩衝液或配膠時的緩衝液用的次數過多，或已經不能用了，電泳緩衝液可用4-5次。
（7）電泳完畢後用染色液染膠至少1小時，脫色2至5小時（根據膠的厚度），其間換脫色液2-3次，可用水繼續脫色和短期保存膠，或製備幹膠長期保存。
試劑：
30%丙烯酰胺：29g丙烯酰胺，1g N,N’-亞甲雙丙烯酰胺，溫去離子水定容到100ml（請先在棕色瓶子上做好記號定容，丙烯酰胺和N,N’-亞甲雙丙烯酰胺都有毒，要帶手套和口罩操作，不要汙染量桶）
Tris-Gly電泳緩衝液（5倍，1L）：15.1g Tris，94g Glycine，pH8.3，50ml 10%SDS，去離子水定容。
10%過硫酸胺：0.5g過硫酸胺，去離子水定容到5ml。4度保存。（此物容易失活，最好每次少量配置。膠凝不了，凝的時間長或凝得不充分多半是它的問題。過硫酸胺在聚合反應過程中提供自由基。）
脫色液（0.5L）：50ml冰醋酸，225ml甲醇，225ml去離子水。（甲醇有毒）
（或50ml冰醋酸，235ml 95%乙醇，215ml去離子水。）（防止揮發，密閉保存。）
染色液：0.25%（染色效果不好就加大）的考馬斯亮藍溶於脫色液中。
可溶性蛋白的表達沒有固定的方法，對不同的蛋白會有不同的方法，如果抽出的可溶性蛋白不多，可用基本培養基代替LB，用30或25度培養代替37度，IPTG（誘導物）的量也可減少，誘導時間也可變化。下麵的方法僅供參考:
1． 將菌接種於5ml LB（含抗生素）培養基中過夜培養，
2． 將過夜培養物全部接種到200ml含抗生素的 MM培養基中，37度培養4-5小時，加IPTG至終濃度0.5mM（可變），37度培養13小時。
3． 將細胞培養物用20mM的冰冷的Tris-HCl（pH=7.5）濃縮10倍，
4． 在冰上用超聲波處理（power lever為4-5，duty設為40－50％，60-120次脈衝，每30次脈衝後在冰中放30秒冷卻），
5． 4度10000rpm離心10分鍾,
6． 將上清通過0.45um的濾膜（細菌過濾器）
附：MM培養基（1L）
硫酸銨1g，磷酸氫二鉀0.5g，7水硫酸鎂0.2g，7水硫酸亞鐵0.1g
方法一：原生質體法
用作鏈黴菌原生質體的一般步驟作到用過濾器過濾那一步，後麵的操作就和大腸杆菌一樣。
方法二：液氮法
1． 將搖好或從平板（鋪有玻璃紙）上刮下來的菌體放入已經由液氮預冷了的拈砵中，加液
氮，用瓷棒將菌體磨成粉狀，其間可加一兩次液氮。（搖的菌體需先離心去掉培養基）
2． 將粉末收集到冰凍過的瓶子中（可-70度保存）
3． 直接加pH為7.4（或其他）的20mM Tris-HCl到一定體積
用大腸杆菌的方法加上樣液，煮菌體，上樣。（加上樣液之前後一定將菌體盡量打散，可防止菌體不能完全破裂，且加入1M的DTT至終濃度50mM防止加熱時二硫鍵的形成。）
誘導蛋白表達：
1． 取過夜培養物50ul-200ul接種於5ml含抗生素的Universal瓶中
2． 37度搖2小時左右
3． 取一定體積的菌液做陰性對照，其餘的加IPTG至終濃度為0.2mM（可變）（4ml培養基加80mM的IPTG10ul）
4． 37度搖2小時左右
檢測蛋白表達：
5． 取100ul（或更多）培養物，用pH值為7.4的20mM Tris-HCl（或PBS 7.4）濃縮10倍或5倍。（菌體多時也可不濃縮）
6． 加等體積的2倍上樣液（Sampling Buffer），或1／9體積10倍上樣液。（加上樣液之前後最好將菌體盡量打散，可防止菌體不能完全破裂，還可加入1M的DTT至終濃度50mM防止加熱時二硫鍵的形成。）
7． 100度煮2-4分鍾
8． 12000rpm，離心1min（菌體破碎完全時也可不做）
9． 取上清點樣做SDS-PAGE
部分試劑：
1． 蛋白上樣buffer(2倍)（10ml）：
SDS 0.2g，溴酚藍0.0006g，1M Tris-HCl (pH=6.8) 0.8ml，glycerol 1.5ml。
2． 蛋白上樣buffer(10倍)（10ml）：
SDS 1g，1MTris-HCl (pH=6.8)2.5ml，溴酚藍0.003g，glycerol 4ml。
3．1M DTT（二硫蘇糖醇）
3.09g DTT溶於20ml 0.01mol／l 乙酸鈉，過濾除菌，分裝，-20度儲存。
1. SDS-PAGE
2. 將膠切成所需的大小放入轉移緩衝液中15-60分鍾。（膠在不同的緩衝液中會有不同的大小，這一步能讓膠的大小達到平衡。0.7mm的膠隻需平衡20分鍾左右，1.5mm的膠需平衡40分鍾）
3. 將電轉夾板平放在桌麵上（先墊一層保鮮膜），依次在夾板的一麵放上海綿，濾紙，膠（塑料片），膜，濾紙，海綿，關閉夾板。（所有的東西都要先用轉移緩衝液（transfer buffer）浸濕；膠和膜之間不能留有氣泡；需要用潔淨的玻璃棒從一側開始把氣泡趕走；塑料片放在膠的旁邊；蛋白轉移一般用硝酸纖維素膜，光的一麵朝向膠；濾紙的大小和海綿差不多，膜的大小比膠稍微大一點）
4. 將電轉夾板放入電轉槽中，有膠的一麵朝向負極，電轉槽中可放入攪拌子，在電轉時攪拌可是緩衝液離子和溫度保持均一，電轉應在4度（冰箱中）進行，可30V過夜電轉或70V電轉5小時。
5. 拆開電轉夾板，將膜放入潔淨的培養皿（7cm）中，用麗春紅（Ponceau S）染液染色5分鍾，室溫，緩慢搖動。用去離子水脫色數秒鍾，傾出去離子水，可以看見蛋白質紅色的條帶。（此步可不做，染色並不是很清楚。）
6. 用TBS潤洗膜10分鍾，脫去麗春紅為止，如果沒做第五步，則隻需稍微潤洗兩三次即可，去掉SDS和電轉緩衝液。
7. 倒掉所有的TBS，用封閉液（blocking solution）浸泡膜一小時，室溫（或4度，過夜），輕輕搖動
8. 用TTBS將膜潤洗兩三次（不需停留）
9. 將膜泡入含一抗的封閉液中，室溫，輕搖2小時
10. 將一抗收集可在4度保存至少1-2周仍然有活性，（含有終濃度為0.02％的疊氮化鈉防腐）
11. 重複8
12. 用含二抗的封閉液孵育1小時，收集含二抗的封閉液同步驟10
13. 重複8
14. 加顯色液NBT-BCIP（10ml），暗處顯色，搖動，5分鍾至數小時內可顯色好。
試劑：
ponceau S Stain（麗春紅染液）：
1ml冰醋酸，0.5g Ponceau S，去離子水100ml
TBS：
150mM NaCl，25mM This-HCl （pH＝7.4）
TTBS：
0.5％ Tween-20 in TBS
封閉液（blocking buffer）（約2％）：
2.5g脫脂奶粉 用TBS定容到100ml，電爐上加熱（用大些的容器防止產生大量氣泡），冷卻，用玻棒刮去表麵的油脂，再加熱冷卻數次，濾紙過濾，用去離子水定容到100ml。長期保存需加疊氮化鈉至終濃度0.02％。
Transfer Buffer（電轉緩衝液）：
300ml甲醇，3.64g Tris Base，21.6g Glycine，去離子水定容到1.5L
注：
電轉的容器需最後用去離子水漂洗。所有的操作都要戴手套，防止手上的油脂和蛋白汙染膜，也避免SDS，甲醇等試劑沾到手上。用一個洗淨了的培養皿和保鮮膜做雜交和洗膜、顯色等操作。
硝酸纖維素膜使用浙江台州的，0.45nm孔徑，130nm厚度
使用北京六一電泳儀器廠生產的電轉槽（40B）。
二抗用AP偶聯的羊抗小鼠或羊抗兔抗體，使用NBT／BCIP染色試劑盒進行顯色（華美，NBS82112天源代理）
抗體的稀釋比例請參照產品說明和經驗。
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