鏈黴菌實驗操作5

   1. 在MS平板上鋪上已滅菌的玻璃紙，接種適量的孢子懸液，塗布均勻，30度培養適當時間，刮取菌絲體,在預冷的碾缽中加入液氮碾磨2~3次。收集粉末狀菌絲體小半勺於1.5 ml的指型管中。加入250 ul的懸浮緩衝液混勻置於冰上。

   2*.收集液體培養物(洗過的), 加入溶菌酶溶液（溶菌酶的終濃度為2 mg/ml，用P Buffer稀釋）使終體積250 ul。 於30度水浴15 min(原生質體剛開始形成)。

   3. 加入70 ul EDTA(0.25M) , 混勻。

   4. 加入375 ul的裂解緩衝液充分混勻，溶液呈清亮狀。

   5. 加入等體積的熱酚, 用手震蕩混勻, 於65度水浴5 min。 (a.水飽和酚應提前於65度加熱, 高溫下, 酚的溶解度加大。b. RNA在堿性環境中易分解。)

   6. 13,000 rpm離心5 min, 取上清。 (室溫下, 酚仍有少量與水混溶, 因而上清為乳白色。)

   7. 再次加入等體積的熱酚, 震蕩混勻,  於65度水浴5 min. 13,000 rpm離心5 min, 取上清。

   8. 加入等體積酚/氯仿(1:1), 震蕩混勻, 13,000 rpm離心5 min, 取上清。

   9. 加入等體積的氯仿, 震蕩混勻, 13,000 rpm離心5 min, 取上清。 (一定要充分震蕩, 以除盡殘餘的酚, 否則, 酚會對後續實驗造成不良影響。)
   10.加入1/5體積的LiCl(10M), 兩倍體積的無水乙醇, 混勻, 於-20度放置2 hr。

11.於4度, 13,000 rpm, 30 min, 有白色沉澱。

12.用80%的冰乙醇洗兩次（在冰上進行），以將鹽離子去除幹淨。

13.冷凍真空幹燥。

14.溶於適當的DEPC處理過的水中，於-70度保藏。

 

注：1. 所有的槍頭、指型管均需用DEPC(0.1%)（Takara）水處理。DEPC為油狀，不溶於水，應充分攪拌，使其均勻分散。

    2. 所有操作必須戴上手套，而且手套要經常換。

      3. 水飽和酚： 將重蒸酚適量裝於一密閉瓶中，加入酚的1/2體積的去離子水，混勻，於65℃溫浴，使酚充分溶解於水。

 

   反轉錄：1. 反應體係（50 ul）

              模板（去除了DNA的RNA）            * ul

              引物（可以隻是下遊引物）（50 pmol/ul）   1 ul             

              dNTP (10 mM)                          1 ul 

              MgSO4                                2 ul

              5* buffer                               10 ul

              AMV                                  1 ul

              H2O                                   至50 ul

           2. 反應程序：

              模板、引物和水混合後60(或65)度保溫4 min（保證mRNA的強二級結構完全打開），取出置於冰上再加入其他成分（避免AMV高溫失活）。

              48℃           45 min

              95℃           2 min

              4 ℃           5 min

              產物於-20℃保藏。

反轉錄產物可不經純化直接用於常規PCR擴增。

 

注：1. 引物設計見常規PCR擴增。但要保證引物之間不會有幹擾。

2. 模板中的DNA要去除幹淨，做好陰性對照。（即以RNA為模板進行相同的反應。）