四、基因片段轉移技術
大腸杆菌CaCl2法製備感受態細胞及DNA轉化
1. 挑取保存的感受態細胞在LA平板上劃單菌落。
2. 挑取長好的單菌落接入到裝有5ml LB的universal瓶中，搖床過夜培養。
3. 從universal中取1ml過夜培養物，轉接於裝有20ml LB（用SOC或SOB可提高感受態效率）的250ml三角瓶中，培養2.5~3小時至OD600＝0.6
4. 將培養物倒入50ml已預冷的大離心管中，置於冰上待冷卻
5. 離心，4℃.5000rpm.3分鍾
6. 倒去上清液，先加少量0.1M CaCl2 ，打散沉澱，再加10ml，混勻，於冰上放置至少30分或過夜。
7. 離心，4℃.5000rpm.3分鍾
8. 棄上清，加1ml 0.1M CaCl2，在冰上輕輕打散沉澱，即可使用。
以上步驟均需注意無菌和低溫操作。
1. 取100μl感受態細胞和5μl的酶連產物或1-2ul質粒混合
2. 冰上靜置30分鍾
3. 42℃熱激90秒，然後在冰上放置5min
4. 加0.75ml LB培養基，在37度搖床上培養45分鍾。然後3600轉離心2分鍾，去掉大部分上清。（此步不作為快轉，作為慢轉，慢轉可提高效率，有些抗生素如Kan篩選時用慢轉較好）
5. 塗布於有抗生素的篩選平板，一般12小時可有轉化子出現。
1. 從轉化子平板上挑取單菌落，在另一平板上劃小方塊，37℃擴大培養12小時
2. 刮取適量（偏少）的菌體懸浮於30μl快檢液I溶液中振蕩均勻
3. 加入15μl堿性SDS溶液（0.3mol/L NaOH, 2%SDS）（天冷時先使該溶液預熱），立即振蕩混合完全。
4. 在70℃放置15min（對大於20kb的質粒則最好放在55℃, 30min）水浴時間不宜過長。
5. 冷卻至室溫，直接上樣跑瓊脂糖凝膠電泳檢測（如果菌體過多，則點樣時會發現樣品很粘，所以掌握不好時可以在第4步之後加上一部5ul苯酚抽提，離心的步驟。）
＊ 如果沒有用苯酚處理，看膠時會發現很明顯的總DNA的條帶，但不影響實驗結果的觀察。
＊ 點樣時注意點上質粒載體質粒對照，一般在快檢時會出現質粒CCC構型的條帶，有時也會出現OC構型的。
＊ 快檢液I：0.3M蔗糖，25mM pH8.0 Tris-HCl，0.5mM EDTA，0.02％溴甲酚綠
1.帶有oriT的目的質粒轉化進入大腸杆菌ET12567( pUZ8002),得到轉化子;
2. 將轉化子的過夜培養物轉接在LB中，在合適抗生素下,37 oC培養轉化子,到合適濃度(OD600:0.4-0.6)收集菌體;
3. 用等體積新鮮的LB洗滌菌體兩次(洗掉抗生素), 0.1倍體積的LB懸浮.備用;
4. 鏈黴菌孢子的熱激和預萌發（一般的接合轉移隻須做熱激）
(1)新鮮孢子懸浮於5ml 0.05M PH8.0 的TES;
(2)50ºC水浴熱激10分鍾;
(3)冷卻到室溫後加入等體積2X孢子預萌發培養基;
(4)37ºC搖床分別培養2-３小時;
（5）離心收集孢子並重新懸浮於適量的水或TES中;
（6）在振蕩器上打散孢子
或隻作熱激按下麵步驟：將適量的孢子加入1ml SOC或2倍YT培養基，50度處理10分鍾，離心，去大部分上清。
5. 按(1*e-8)：(1*e-9)與3中的大腸杆菌混勻(不一定)
6. 30ºC培養13-20小時左右用適當濃度的抗生素和萘啶酮酸（抑製大腸杆菌）覆蓋
6. 30ºC培養數天（一般2天）可得到接合轉移子.
7. 挑選接合轉移子到含適當抗生素和萘啶酮酸的平板上, 驗證;
（作篩選雙交換菌株時繼續作下麵步驟）
8. 直接將得到的接合轉移子作影印，尋找單抗的菌株即為雙交換菌株。如果得不到，就要通過單交換菌株的鬆弛培養來得到雙交換菌株。得到的單交換接合轉移子劃線
於合適的培養基(含萘啶酮酸，不含別的抗生素)鬆弛培養;
9. 得到的孢子或菌體稀釋塗皿或劃單菌落（for Bld菌株）, 影印篩選雙交換.
注意事項:
1 不同的孢子熱激的溫度和時間不同,預培養的時間不同.
2 不同的鏈黴菌接合轉移所用的培養基不同
預萌發培養基
Difco 酵母膏 1%
Difco 酪蛋白氨基酸 1%
CaCl2 0.1M(需配製5M的原液,分開滅菌後加到酵母膏/酪蛋白氨基酸溶液中去)
鏈黴菌原生質體的製備
1. 在裝有不鏽鋼彈簧的三角瓶中加入250ml的YEME+TSBY(1:1)(一定要加Glycine)，接種100ul的孢子懸液，於30度搖床中培養36~40 hr（視具體情況，有時培養24h已足夠。）。
2. 將培養物倒入universal中，用無菌水涮洗三角瓶，收集洗液於同一universal中，然後3000 rpm離心10 min。
3. 棄上清，將菌絲體懸浮於15 ml的10.3%的蔗糖溶液中，3000 rpm離心10 min，棄上清。同此法洗兩次。
4. 取1 ml菌絲體，加入4 ml的溶菌酶溶液（溶菌酶母液為50mg/ml P Buffer，終濃度為2 mg/ml，用P Buffer稀釋），於30度水浴30~60 min（間隔七八分種輕輕搖動）至上清呈乳狀。
5. 加入5 ml的P Buffer並用5 ml的吸管吹吸幾次，繼續溫浴10 min。（使大量的原生質體釋放出來。）
6. 用裝有脫脂棉的試管過濾，濾液轉入無菌幹淨的universal中，3000 rpm離心7 min（不用brake檔防止其破裂）。原生質體沉澱呈黃色。
7. 棄上清 ，輕柔打散原生質體，用P Buffer洗兩次（洗去溶菌酶）。每次仍使用3000 rpm離心7 min。（此步可省略）
8. 棄上清，用槍將原生質體打散，分裝，於-70度保存。
注：1.. P緩衝液（原生質體轉化用）（Okanishi, 1974）
蔗糖103g，K2SO4 0.25g, MgCl2·6H2O 2.02g, 微量元素溶液 2ml，蒸餾水 800ml
滅菌後每80ml上述溶液中加入：0.5% KH2PO4 1ml, 3.68% CaCl2·2H2O 10ml, 5.73% TES 緩衝液(pH7.2) 10ml
2．溶菌時間不能過長，否則會使原生質體破裂。離心後若看到很粘的絮狀物，則說明原生質體破裂。
1. 將最多5 ul的DNA（質粒或酶連產物）加於已經裝有50 ul原生質體的指型管（1.5 ml）的管壁上（不與原生質體接觸）。
2. 吸取200ul的25% PEG4000（PEG應先滅菌，再用P Buffer配置），將DNA衝入原生質體中，小心抽吸幾次使之混勻。
3. 將混合物塗布於R5平板上（不含任何抗生素）。
4. 30度培養14~20 hr後（待原生質體再生後，即平板呈霧狀），用含有適當抗生素的1 ml無菌水溶液覆蓋。
5. 再培養1~2 d後，可以看到小的轉化子菌落長出。
1. 將天藍色鏈黴菌庫斯質粒轉化進入大腸杆菌BW25113/pIJ790*菌株中，此步可用常規的CaCl2 法。（pIJ790帶有cat基因和對溫度敏感的複製區，培養時溫度要嚴格控製在30゜C以下）
2. 培養含庫斯質粒的BW25113/pIJ790菌株：從平板上挑取大腸杆菌單菌落接入5ml 含25ug/ml Cml,100ug/ml Amp的SOB-MgSO4 （不加MgCl2 的SOB中加入MgSO4至20mM ）中，30゜C搖床培養過夜。
3. 取一部分過夜培養物至25ml新鮮的SOB-MgSO4 培養基（含25ug/ml Cml,100ug/ml Amp）中，菌體終濃度為1% ，添加250ul 1M L-阿拉伯糖誘導λ/red 重組係統。
4. 30゜C ，200rpm搖床培養3-5h 至OD600~0.6 。
5. 將培養物倒入預冷的30ml離心管中，冰上置10min(從此細胞溫度要保持在0~4゜C)。4000rpm 4゜C離心 5min。
6. 棄掉上清，加1ml預冷的10%甘油，在冰上打散沉澱，再加9ml 10%甘油,搖勻。
7. 4000rpm 4゜C離心 5min，棄掉上清，用10%甘油洗滌。重複上麵操作：4000rpm 4゜C離心5min，盡量棄去上清，用殘留液將細胞打散。（感受態細胞濃度越高電轉效果越好）
8. 在預冷的0.2cm的電轉化杯中混合50ul感受態細胞與1-2ul PCR產物（經純化，可盡量濃，但不能加得過多），混勻後立即電擊，電擊條件：200Ω,25uF,2.5kv, 電擊結果為4.5~4.9ms 較理想。（電轉化杯在70％乙醇中保存，用前先在無菌環境下用無水乙醇洗一下，再吹幹，放冰上預冷，無水乙醇能加快吹幹的速度。也可以選擇0.1cm的電轉化杯，但電擊的參數就得變為：1.8 kV，？Ω,?uF）
9. 立即加1ml預冷的SOC，37゜C誘導培養40min（如需在同一庫斯質粒上中斷基因，則30゜C誘導培養）。
10. 塗LA（含100ug/ml Amp及與電轉片段攜帶的抗性標記相應的抗生素）平板，37゜C過夜培養。（轉化子中含有兩種質粒，分別是重組前和重組後的質粒，所以要抽質粒再轉化一次DH5a）
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